5-氟胞嘧啶热化疗对裸鼠肝癌治疗机理研究.pdf

llllIJfllfllffllff[ff[1lflgflflflflr llllUl Y1 806198 5．氟胞嘧啶热化疗对裸鼠肝癌治疗机理研究 研究生：张 成 专 业：普通外科专业 导 师：苏旅明 教授 中文摘要 目的 探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶／5．氟胞嘧啶(CD／5．FC)系统热化疗对转CD 系统热化疗对裸鼠肝癌的抑制作用。 方法 将质粒PCD2和G1 AFPCDNa在感受态细菌中大量扩增，碱法抽提质粒， 质粒PCD2用BamH1酶和EcoRl酶切鉴定，质粒G1AFPCDNa用Sal1酶切鉴定 8RPMll640 并测序；用脂质体法分别转染肝癌SK．HEP—l细胞，以含400mg／IG4l 培养液选择培养，14天后挑选抗性克隆并大量扩增，RT．PCR检测目的基因的 表达情况；在96孔细胞培养板中分别对两种转基因SK．HEP．1细胞进行前药 5．FC热化疗，MTT法测活细胞比率并计算细胞杀伤率，并比较两种转基因的细 细胞总RNA，用实时荧光定量PCR(Real．TimePCR)检测热化疗前后 表达有无差异。随后将90只裸鼠随机分为三组：对照组、AFPCD热疗组、 AFPCD非热疗组，每组30只，脾内注射法建立肝癌动物模型，对照组腹腔注射 生理盐水，热疗组腹腔注射43℃5一FC，非热疗组腹腔注射不加热5一Fc，观察各组 裸小鼠的肝癌生成率、肝癌数目、光镜以及电镜下肿瘤组织病理学变化、肿 瘤细胞凋亡指数，裸鼠生存期等指标，RT-PCR检测各组肿瘤组织中CD基因的 表达情况，同时检测裸鼠胰腺，胃，结肠组织中CD基因有无表达。 结果 质粒PCD2用BamHl酶和EcoRl酶切鉴定可见1．5k酶切片段；质粒 G1AFPCDNa用Sal 公布的E—CD序列一致，脂质体法将PCD2和G1AFPCDNa转染肝癌 G1 的表达活性明显增强：5一FC转基因细胞热化疗证明SK．HEP一1一 和0．98mmol／1，表明在组织特异性驱动子TRS驱动下，目的基因的表达活性明 RT-PCR)检测得到热化疗前CD 显增强；实时荧光定量PCR(Real—Time 对定量比较无明显差异(P0．05，t=1．452l，v=38)，表明热疗不会影响转染基因 物干预后四周后，对照组有30只成瘤，成瘤率为1oo％；非热疗组有24只成 瘤，成瘤率为80％；热化组9只成瘤，成瘤率为30％；肿瘤肝脏种植率非热疗 组与对照组无明显差异(P0．05)，而热疗组与对照组比较有显著差别(P 4-2．85 O．01)，平均肝癌数(x±S)对照组为l3．64-8．79个，非热疗组为5．6 个，热疗组为0．64-0．65个，热疗组与非热疗组平均肝癌数目明显少于对照组， 差异有统计学意义(P0．01)；普通病理可见对照组肿瘤组织中，肿瘤细胞生 长活跃，并可见细胞核分裂相和瘤巨细胞；而在非热疗组肿瘤组织中，瘤细胞 数减少，肿瘤细胞空泡变性，细胞核皱缩，边集甚至消失，特别是在热疗组肿瘤 组织标本中更加明显，仅残留少量肿瘤细胞，并可见散在的成纤维细胞，淋巴细 胞和嗜酸性粒细胞；透射电镜下可见对照组肿瘤细胞呈不规则形，体积较大， 核大，核仁明显，核分裂相易见，细胞浆内细胞器丰富，但无明显的凋亡小体；热 疗组大量肿瘤细胞呈胞体凝缩，胞质浓缩，核糖体及线粒体聚集，细胞核固缩， 核碎裂等表现，并可见大量