细胞生物学 第三章的研究方法.ppt

第三章 细胞生物学研究方法和技术 主要内容 一、显微镜技术 二、细胞组分分析方法 细胞组分分级分离技术 细胞化学和免疫化学技术 放射自显影技术 三、细胞培养技术 四、细胞工程技术 一．显微镜技术 ＊种类 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源 普通光学显微镜 荧光显微镜 相差显微镜 (光学原理和结构) 暗视野显微镜 倒置显微镜 激光共聚焦扫描显微境 微分干涉显微镜 电子显微镜：以电子束为光源 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 光学显微镜 1．普通光学显微镜 (1) 结构： ①照明系统(光源,聚光镜) ②光学放大系统(主体) （物镜、目镜） ③机械装置 (镜筒、物镜转盘、调焦旋钮、载物台、镜臂、底座） 普通光学显微镜 (2) 原理： 经物镜形成倒立实 像，经目镜放大成虚 像。 普通光学显微镜 （3）分辨率（resolution） 显微镜最重要的参数是分辨率，而不是放大倍数 ①概念 分辨率：显微镜下能区分两个质点间的最小距离 放大倍数：物镜放大倍数 * 目镜放大倍数 有效放大倍数：达最大分辨率时的放大倍数 ②计算公式 分辨率 D = 0.61λ/ N *sinα/2 （λ: 光源波长; α: 物镜镜口角; N: 介质折射率） ③ 决定分辨力大因素 波长、镜口率（NA= N*sinα/2）、介质的折射率 ④普通光镜的最大分辨率D＝0.2μm,放大达1000倍（450nm,140,1.5) 光学显微镜 2. 荧光显微镜 （fluoresence microscope） (1)特点： 光源为短波长光(紫外光） 有两个特殊的滤光片 照明方式通常为落射式 尼康E800荧光DIC显微镜 荧光显微镜 （2）原理 高压汞灯放出的紫外线作为光源，经过滤光器过滤的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光，再经过物镜和目镜放大进行观察。 荧光显微镜 （3）应用 是目前在光镜水平上对蛋 白质等生物大分子进行定 性定位定量研究的最有用 的工具。 包括： ＊荧光染料直接标记技术 ＊免疫荧光技术（用荧光抗体来 研究特异蛋白抗原在细胞中的分 布） △绿色荧光蛋白（GFP） 荧光标记显微照片 LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) 光学显微镜 4、相差显微镜 （phasecontrast microscope） （1）结构特殊性 ①聚光器上增加一个环行光阑 ②物镜中装一个环形相位板 （2）原理 把透过标本的可见光的光 程差变成振幅差，使活细胞 内部结构之间呈现清晰的明 暗对比，从而可以观察活细 胞的细微结构和变化。 相差显微镜 （3）应用 不经染色，直接观察无色透明的活细胞中细微结构，可用于研究培养细胞中的核、线粒体的大细胞器的动态。 光学显微镜5、倒置显微镜 inverse microscope 正置显微镜 倒置显微镜 倒置显微镜结构特点：物镜和照明系统颠倒（有的具有荧光装置） 倒置显微镜应用：用于观察培养的活细胞或用于显微操作. 透射电子显微镜（transmission electron micr