产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌构建及发酵条件优化研究.pdfVIP

摘 要 α-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界生物体内，种类繁多，性质各异。它是一种限制性 水解酶，可从低聚糖类底物的非还原末端切开 α-1，4 糖苷键，释放出葡萄糖，或将游 离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成 α-1，6 糖苷键，从而得到非发酵性的低聚 异麦芽糖或糖脂、糖肽等。 α-葡萄糖苷酶应用于生产低聚异麦芽糖，受到食品工业界的重视。但生产过程中的 环境条件对酶活影响很大，因此耐热α-葡萄糖苷酶成为研究的热点之一。 本实验以非解朊栖热菌HG102 α-葡萄糖苷酶基因为模板进行PCR 扩增α-葡萄糖苷 酶基因，与表达载体 pET28α(+)连接，转入感受态细胞 DH5α，筛选阳性重组体，酶切 检验，然后把构建好的重组质粒转入 BL21(DE3) ，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG) 诱导表达。诱导后进行细胞超声破碎，蛋白加热沉淀和SDS电泳分析。 结果表明，PCR 扩增得到1 900 bp 左右的DNA 片段，重组基因诱导表达后检测得 α-葡萄糖苷酶酶活，蛋白经电泳分析显示其相对分子质量约为65 KD，与理论值相符。 经测序，克隆的基因序列与文献一致。 对取得的α-葡萄糖苷酶进行了酶学性质的初步研究，α-葡萄糖苷酶的最适pH 为7.0 ， 且在pH 5.0-8.0 条件下具有较好的稳定性。α-葡萄糖苷酶的最适温度为85 ℃，在85 ℃ 条件下热处理3 h 后，α-葡萄糖苷酶的活性约为初始值的60%，具有较好的热稳定性。 对重组菌进行了碳源、接种量、金属离子、IPTG 添加时间、诱导时间单因素培养 条件优化，优化结果：在LB 液体培养基中添加1%甘油和0.01% 的Mn2＋，接种量为6%， 发酵培养2 h 时，添加IPTG 至终浓度为 1.2 mmol/L ，诱导表达16 h，得到的α-葡萄糖 苷酶酶活最高，最终酶活由初始的4.25 U/mL 提高到40.85 U/mL ，提高了8.6 倍。 根据单因素优化实验结果，以α-葡萄糖苷酶酶活为指标，选取接种量、诱导剂添加 时间及诱导培养时间为考察因素，设计三因素三水平的正交实验。三个因素对发酵影响 的主次顺序为：诱导剂添加时间 接种量 诱导培养时间。其最佳工艺条件为接种量 8%，诱导剂IPTG 添加时间2 h ，诱导培养时间20 h 。对重组菌发酵条件进行正交优化 实验后，最终酶活提高到63.53 U/mL 。 关键词：耐热α-葡萄糖苷酶；非解朊栖热菌；基因重组；发酵 I ABSTRACT α-Glucosidase are widely found in organisms with different properties. As restriction enzyme, it can release glucose by cutting α-1, 4 glycosidic bond from the non-reducing end of oligosaccharides, or transferr free glucose residue to the other carbohydrate forming α-1, 6 glycosidic bond, by which non-fermentative isomaltooligosaccharide, glycolipids or glycopeptides are synthesized. α-Glucosidase is paid attention for producing isomaltooligosaccharide used in the food industry. But the activity is impacted by enviroment conditions greatly. So the thermo