高效液相色谱在生物医药研究中应用第九讲抗生素分离与测定.pdfVIP

讲 座 高效液相色谱在生物医药研究中的应用 第九讲 抗生素的分离与测定 龚炳永 周亦昌 上（海医药工业研究院，200040 （中国科学院上海药物研究所 200031） 抗生素是一类微生物次级代谢活性产物。目前 况的反映上均存在严重的欠缺。而高效液相色谱 工业上大都采用发酵法进行生产，或将发酵产物经 HPLC法则无论在精度、速度、重现性、灵敏度以及 化学修饰后形成产品。至今从土壤微生物中发现的 对药物整体分子状况的反映上均具有公认的优点， 抗生素已超过7000种，其中成为临床药品的约90余 是抗生素药品检验与体液中含量测定较为理想的方 种，年产值达160亿美元，是临床上一类重要药物。 法。在新抗生素分离与纯化以及药代动力学等研究 在考虑与选择抗生素药物的测定方法时，需考 中HPLC更是不可缺少的有效手段。本讲着重介绍 虑它们的以下几个特点： HPLC技术在临床上常用的几类抗生素药物测定方 1抗生素产生菌的发酵过程是一个复杂的生物 面的研究进展。 合成过程。有众多的酶参与各级反应。抗生素的多组 9-1 -内酰胺类抗生素 分性已是普遍的现象。一菌多素也不罕见。各组分之 间的化学结构差异甚微，给分析带来一定的困难。而 -内酰胺类抗生素是指由6-APA或7-ACA为 结构上的这些细微差异往往能导致其药效与毒性方 母核的衍生物以及单环内酰胺衍生物。它们是 目前 面的很大变迁。因此，在选择测定方法时必须考虑各 临床上使用最广、品种最多的一类重要抗生素。 组分的分辨率。 由于青霉素与头孢菌素类抗生素在结构上都含 2．抗生素产生菌在发酵过程中除生成目的产物 有羧酸基团，故早期采用离子交换色谱 一（般选用阴 外，还伴随着大量的其它产物。而这些非目的产物虽 离子交换柱）来测定这类抗菌药物。但因所用流动相 经分离、纯化等工序处理，并不能完全除尽。一般对 的pH值往往低于其稳定性的最佳pH值而不甚理 医用抗生素的产品质量都有严格的控制要求，但它 想。近几年大都改用反相色谱法。最常用的分析柱填 们并非纯品。而某些微量杂物的混入往往会引起严 料为ODS-C18。反相HPLC一般具有高效、短时，并在 重的毒性反应，如青霉素多聚物能导致过敏性休克， 含水系统中完成分析等特点。但对具有极性很强的 因此，特定杂质的检出必须予以考虑。 青霉素或头孢菌素品种，如头孢三嗪，分离效果不甚 3．药物的作用与其整体分子及其构型相关。在 理想。在流动相中加入离子对试剂，以改善其分离的 天然药物中，一般地说，抗生素的稳定性较差。有些 选择性。某些在样品中含有立体异构体的品种，如氨 产品在加工、运输与储存等过程中，就部分地发生异 苄青霉素、苯氧乙基青霉素以及羧苄青霉素等，也可 构化如（四环素可部分地转化为4-差向四环素）、自 用离子对反相R（PHPLC来改善其分离效果。 动氧化还原如（多烯大环内酯类抗生素）或降解等变 分析体液中的头孢菌素，首先需作样品的预处 质现象。因此，要求选用的测定方法能反映出药物的 理，主要是去除血清中的蛋白质，以便对非测定物质 整体分子状况，而不仅仅是个别基团或部分特征结 进行粗略分离，同时定量地提取要测定的药物。多数 构的测定，此点甚为重要。 头孢菌素的预处理方法有不少共同点：1蛋白质的 由于大部分抗生素可直接作用于细菌或真菌， 去除，沉淀蛋白质一般有四种方法，以酸、硫酸铵、有 故抗生素的生物效价测定法是常用的一种方法。但 机溶剂或金属阳离子沉淀。头孢菌素HPLC法中最 对多组分的抗生素来说，它不能确切地检定出组分 常采用酸沉淀剂 如（三氯醋酸）和有机溶剂 如（乙腈、 的含量，而且此法费时，精度与专属性亦差。利用理 甲醇）。这些方法适用于头孢菌素的反相色谱分析。 化性质数值与特征结构的光谱分析及化学反应是目 2）液-液提取，采用低极性有机溶剂萃取。常用有乙 前抗生素药品检验中另一常用的方法。但这种方法 腈、