实验三荧光光谱法测定核黄素的含量(卫化预医).docVIP

实验三 荧光光谱法测定核黄素的含量 一、实验目的 1．熟悉 F950型荧光光度计的使用。 2．掌握荧光光谱法测定核黄素含量的基本原理。 二、实验原理 核黄素结构式： 分子式C17H20O6N4，分子量376.37。在水溶解度小，遇光分解，须避光。 含有核黄素的溶液吸收光能后，能发射出荧光，在一定条件（溶液abc≤0.05）下， 荧光的强度与核黄素浓度成正比（IF = Kc)，能作为核黄素含量的测定方法。 三、仪器和试剂 1．0.05 mol/L H2SO4溶液 2．核黄素贮备液（25.00 ?g/ml） 称取2.500 mg（在20万分之一天平）核黄素，移入100 ml烧杯中，以0.05 mol/L H2SO4溶解，移入1000 ml容量瓶，以0.05 mol/L H2SO4稀释至刻度，移至棕色瓶内，冷藏，备用。 3．核黄素标准液（10.00 ?g/m1） 吸取25.00 ?g/ml核黄素贮备液40.00 ml，移入100 ml容量瓶中，以0.05 mol/L。 H2SO4稀释至刻度（临用时配制）。 4．仪器 F950型荧光计、滤光片、石英比色皿 四、F950型荧光计的使用 仪器由光源灯、聚光透镜、滤色系统、比色皿座架、光电检测器、电子系统微安表及稳压电源等部件组成。 仪器的外表和旋钮如图2所示： 图2 F950型荧光光度计主机各部分示意图 1．样品室 2．主机电源开关 3．灯电源开关 4．主机电源保险丝5．灯电源保险丝 样品室：样品室内部如图3所示，样品室盖是掀开式的； 主机电源开关：开关处于ON，电源接通； 灯电源开关：开关处于ON时，灯电源接通； 高压开关：此开关的作用是当样品室门合上时，负高压源输出负高压，光电倍增管处于工作状态。 图3 样品室 1．石英比色皿 2．滤光片 3．比色皿池 4．负高压源开关 （二）开机、关机操作程序 1．开机程序 开灯电源开关→开主机电源开关 开启灯电源开关后，可听到“嚓”的声音，属正常现象。在确认灯源点亮后，才可以以接着开主机电源开关，否则会对电路造成损坏。 仪器所有电源打开后，进入自检程序，显示区最右端翻转l至5的数字，表示自检状态。自检结束，可听到光门自动开启一次的声音，然后显示： 9□280□000 显示区中各部分数字表示仪器默认的功能和所处的波长，000没有意义，只是表示是数值显示区。 2．关机程序 关主机电源开关→关灯电源开关 （三）操作步骤 按GOTO键，指示灯亮→输入波长值→按ENTER键，寻到所需的波长； 指示灯暗→按SENS键，指示灯亮，输入灵敏度值→按ENTER键，选择合适灵敏度； 按光门SHUT键，指示灯暗→放入样品，关闭样品室门→按光门SHUT键，指示灯亮，显示荧光值。 不进行样品测试时，需关闭光门，即SHUT键左侧指示灯处于暗状态。 五、核黄素含量的测定 1．标准的绘制吸取10?g/ml核黄素标准液000、0.50、1.00、2.00、3.00 ml，分别置于25 ml比色管中．各管再加05 mol/L H2SO4至刻度摇匀以最高浓度管定位于调，然后分别测定各标准管的荧光强度F(X)），扣除管的荧光强度F(0)），即为相对荧光强度(X)-IF(0)），以核黄素的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标作图，绘标准曲线。 ．样品测定吸取10ml样品液于25 ml比管中，加005 mol/L H2SO4至刻度．测其荧光强度(A)）．样品的相对荧光强度应为F = IF(A)-IF(0)，根据F值．在标准曲线上查出被测样品的核黄素含量。 1．核黄素的结构式中，哪些是产生荧光的基团?请在结构式中表示出来。 2．从理论上阐述实验结果荧光发射波长和激发光波长的相互位置关系。 3．解释为何要先用调一定荧光强度，才能测试样。