食品中肉毒梭菌的PCR检测方法.docVIP

食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ检测方法 科标检测 1、范围 本标准适用于食品中Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的检测。 ? ?青岛科标检测研究院通过了山东省质量技术监督局（CMA）和中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认证认可，是权威的第三方检测机构。旗下科标生物实验室在微生物检测领域拥有丰富的经验，可以针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析，为客户提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，保证产品质量安全，专业得到了国内、国际知名企业的广泛认可。可以按照各种标准提供微生物检测服务。 规范性引用文件 ＧＢ／Ｔ４７８９．１２　食品卫生微生物学检验　肉毒梭菌及肉毒毒素检验 ＧＢ／Ｔ６６８２　分析试验室用水规格和实验方法 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求 3、术语、定义和略缩语 3.1肉毒梭菌　 肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。 3.2聚合酶链式反应 模板ＤＮＡ先经高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（ｄＮＴＰ）为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的ＤＮＡ片段呈几何倍数扩增。 3.3缩略语 Bp 碱基对 DNA 脱氧核糖核酸 dNTP 脱氧核苷三磷酸 dATP 脱氧腺苷三磷酸 dCTP 脱氧胞苷三磷酸 dGTP 脱氧鸟苷三磷酸 dTTP 脱氧胸苷三磷酸 Taq 水生栖热菌 Tris 三（羟甲基）氨基甲烷 EDTA 乙二胺四乙酸 4、生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有关规定执行。 5、防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的规定执行。 6、方法提要 样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到ＴＰＧＹ培养，对培养物采用热裂解抽提ＤＮＡ法，或商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒抽提ＤＮＡ法制备ＰＣＲ模板，进行ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳检验ＰＣＲ产物是否有特征条带，从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。 7、设备和材料 7.1天平：感量０．００１ｇ。 7.2生物安全柜。 7.3厌氧培养装置。 7.4恒温培养箱：３５℃±１℃和２８℃±１℃。 7.5高压灭菌锅。 7.6恒温水浴：３７℃±１℃和６０℃±１℃。 7.7速台式冷冻离心机：１４０００ｇ。 7.8冰箱：－２０℃和－７０℃。 7.9ＰＣＲ仪。 7.10电泳仪。 7.11凝胶成像分析系统。 7.12紫外分光光度计。 7.13微量可调移液器：０．２μＬ～２μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。 7.14离心管：１．５ｍＬ。 7.15ＰＣＲ反应管：２００μＬ～５００μＬ。 8、培养基和试剂 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。 8.1庖肉培养基 8.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（ＴＰＧＹ） 8.3厌氧卵黄琼脂 8.4无水乙醇和９５％乙醇 8.5ＰＢＳ缓冲液：氯化钠７．６５０ｇ／Ｌ、磷酸氢二钠０．７２４ｇ／Ｌ、磷酸二氢钾０．２１０ｇ／Ｌ（ｐＨ７．４） 8.6ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） 8.7蛋白酶Ｋ溶液：用ＴＥ配制，使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ 8.8溶菌酶溶液：用ＴＥ配制，使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ 8.9３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠溶液（ｐＨ５．２） 8.10２０％ＳＤＳ溶液 8.11引物：根据附录Ｂ中表Ｂ．１的序列合成引物，加超纯水配制成１００μｍｏｌ／Ｌ储液，用于ＰＣＲ测试的引物浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ。 8.12TaqＤＮＡ聚合酶 8.13ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。 8.14琼脂糖：电泳级 8.15溴化乙锭 8.16ＤＮＡ分子量标准 8.17阳性对照：含有扩增片段的质粒或Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ 8.18商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒 8.19１０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。 8.20５×ＴＢＥ