培养神经元及肝细胞蛋白质样品制备方法的比较研究.pdfVIP

泸州医学院学报 2004年 第 27卷 第3期 JournalofLuzhouMedicalCollege Vo1．27 No．3 2004 2Ol 培养神经元及肝细胞蛋 白质样品制备方法的 比较研究* 李 娟，甘 淋，何 涛，李 洪 (泸卅I医学院中心实验室； 生物化学教研室，四川泸州 646OOO) 摘 要 目的：优化神经元和肝细胞蛋 白样品的制备方法，以提高双向电泳分析结果的正确性和可靠性。方 法：采用不同的细胞裂解液在不同的裂解条件下提取培养神经元或肝细胞的全细胞蛋白质，考马斯亮蓝G一250测 定蛋白质含量，SDS—PAGE、双向电泳对蛋 白质进行电泳分离。结果：蛋白质含量测定及电泳图谱0~x,-J比分析可见， 用酶消化法和机械收集法所得蛋白质样品含量均较直接裂解法低；蛋白质抽提液中还原剂及去污剂的不同选择对 结果的影响较大。结论：采用培养瓶中细胞直接裂解法较酶消化或机械收集法收集细胞再提取蛋白质更为有效， 还原剂TBP有利于提高蛋白质双向电泳结果的质量，在去污剂的使用方面神经元裂解宜采用4％CHAPS，而肝细胞 裂解则宜采用 2％TritonX一100。 关键词 细胞裂解；电泳；蛋白质；去污荆；还原荆 中图分类号 Q503 文献标识码 A 文章编号 】000—2669(2o04)3—0201—03 蛋白质组 (pmteome)分析技术路线中的第一个 氨酸(glycine)、四甲基乙二胺 (TEMED)、三羟 甲基氨 重要环节为组织、细胞中的蛋白质提取，它将直接影 基 甲烷 (Tl-is)、矿物油(为Bio—rad公司产品)；考马 响双向电泳(tWO—dimensionalelectmphoresis，2一DE) 斯亮蓝G一250、胰酶和 EDTA(为Sigma公司产品)。 等后续研究结果。由于细胞内蛋白质组成复杂，具 其余试剂均为国产分析纯。 有大量中、低丰度蛋白质，且不同组织细胞的蛋白质 1．1．3 蛋白质抽提液 组成具多样性和异质性，当前仍没有一种制备方法 8mol／L尿素、1％TBP或 l％DTI、CHAPS或Tri— 可以普遍适用于各种细胞，因此，如何针对不同的细 otonX—100、0．2％Bio—lyte。 胞样品尽可能多地提取细胞蛋白质是一个亟待解决 1．2 仪器 的问题。作者尝试使用不同的方法对培养神经元及 UVI100紫外 一可见分光光度计(北京瑞利分析 肝细胞的蛋 白质进行提取，并对结果进行了对 比分 仪器公司)；等电聚焦电泳系统、垂直电泳系统 (Bio 析，以期寻找一种较为优化的神经元或肝细胞蛋白 — rad公司)；5417R高速低温离心机 (EPPENDORF 样品制备方案。 公司)。 1 材料和方法 1．3 实验方法 1．1 试剂和溶液配制 1．3．1 细胞培养 1．1．1 培养基 取新生乳鼠(出生后 I～2天)，在无菌的条件 RPMIl640、NEUROBASALTM Mediunl、 ，supple 下，开颅取出大脑组织及开腹取出肝组织，用 Hanks ment(为 G1BCO公司产品)。 液洗去血渍，剪碎，胰酶消化，制成细胞悬液，离心、 1．1．2 电泳试剂