单管PCR定量检测K-ras基因第12、13密码子突变方法建立及胰腺癌诊断价值评价.pdf

单管PcR定量检测K．ras基因第12、13密码子突变方法的建立及胰腺癌诊断价值评价 捅要 cancer)是消化道常见的恶性肿瘤之一，其发病逐年增加， 胰腺癌(pancreatic 已被称为2l世纪恶性肿瘤之王。胰腺癌丰要是指胰腺外分泌胰腺癌，各种病理分 型中最常见的是导管腺癌。胰腺癌的预后极差，5年生存率低于5％，在美国胰腺癌 J。胰腺癌的人群发病率为6／10万至10／10 死亡率在所有癌症死亡率中排在第4位【l 万【2】’近年来呈现上升的趋势，并且有年轻化的倾向。绝大多数胰腺癌患者在诊断 明确时已属晚期，只有10．20％的患者在诊断明确时尚具有进行手术切除的机会。 因此胰腺癌的早期诊断尤为重要。但目前临床上缺乏有效的进行早期胰腺癌的筛查 方法，而慢性胰腺炎、胆管炎等与胰腺癌的临床特征较相似，其与胰腺癌的的鉴别 诊断也是临床的一大难题。因此，提高胰腺痛的早期诊断率，是使得更多忠者能获 得手术切除机会的重要途径。K．ras基因突变在胰腺癌患者的胰腺组织、胰液、粪 便及血液均有发现，其中胰腺癌组织中最为常见，其突变频率为75％～95％。K-ras 基因突变的常见位点为第12、13、6l密码子，其中以发生在第12密码子的突变最 为常见。 sequencingmethod，DNA直接测序法)，PCR·RFLP(restrictionfragmentlen舒h strand conformation refracto叫 mutation system，扩增受阻突变体系)及PCR．MASA(mutantalIeIe．specific 检测K．ras基因突变的Hi曲resolution Linked EnzymeMini-sequenceAssay(ELMA)，LigAmpassay等方法，然而，这些 方法普遍存在检测时间过长或操作较繁琐等缺点。并且，敏感性和特异性不够的问 题，也限制了它们的广泛应用。 本实验室前期已建立了一种双荧光标记探针联合肽核酸的实时定量PCR检测 K．ms基因12密码子突变的方法，其检测探针为针对第12密码子第一位碱基突变 三种类型的简并探针K．ras．FAM MGB探针和针对第12密码子第二位碱基 Tagman 突变三种类型的简并探针K．豫s．VlC MGB探针。结果证实此检测方法能有 Tagman 效地检测K．ras基因第12密码子的六种突变类型，并具有较高的灵敏度 (1／lO。．1／105)。通过对几种胰腺癌细胞株的检测，证实此检测结果和测序结果完全 吻合。本研究的目的在于，在本实验室前期建立的双荧光标记探针联合肽核酸的实 时定量PCR检测K．ras基因第12密码子突变的方法的基础上，通过改良优化，建 第二军医大学硕士论文 立一种能同时定量检测K．ras基因第12密码子及13密码子突变的PCR方法，并将 其应用于胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人群中的外周血标本检测，评价其检测效率以 及鉴别诊断胰腺痛的价值。 ’ 的建立 目的：建立单管PCR定量检测K．ras基因第12及13密码子突变的方法，并检 验其灵敏度和特异度。 方法：设计分别由FAM、VIC及NED标记的K．ras．FAMMGB探针、 Tagman K—ras．VlC TagmanMGB探针及K．ras．NEDTagmanMGB探针。其中K．ras．FAM MGB探针为针对K．ras基因第12密码子六种突变类型的简并探针， Tagman K．ras．VIC TagmanMGB探针为针对K．ras基因第13密码子六种突变类型的简并探 针，K．ras-NEDMGB探针为针对K．ras基因第12、13