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核酸分子杂交技术 DNA印迹与杂交技术 组长：朱珂珂 王嘉琪 张海鸿 郭伟伟 陈磊 周术媛 冯璐 一、 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 三、Southern blotting DNA印迹与杂交 1975年，英国Edwen Southern创建 定义：DNA杂交方法，即将DNA电泳分离、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern bloting的主要步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 在 凝胶中DNA的变性为碱变性 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。 4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ?非特异吸附少 4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜 ②尼龙膜 ③化学活化膜 4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。 （3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。 核酸技术的应用 核酸印迹技术在DNA与RNA鉴定上有很广泛的应用 遗传病的检测 特异基因的定位 分析重组质粒 检测组织或细胞中mRNA的特异性表达 …… 核酸印迹技术的应用 例如：遗传病的判断 在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。 由此可发现基因的缺陷，以此来判断一些遗传病症。 Thanks