PCR技术应用.pptVIP

PCR是一个英文简称缩写，通常用于很多学术名词的缩写，包括生物学的聚合酶链式反应，电子信息学的光电导继电器，计算机学的程序控制暂存器，电子学的节目时钟参考，口腔行业的术语表膜清洁率。 诊断 细菌，病毒，寄生虫检测 肿瘤 各种肿瘤检测 研究 DNA测序，分析突变，基因克隆 人类基因组工程 遗传图谱的构建，表达图谱，DNA测序 其他 … 病原体测定 肿瘤研究 基因突变及多态性的研究 其他方面 FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。 由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。 　　 Morris等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。 意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。 美国Ibrahim等1997年用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。 日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。 是以基因组DNA 作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3 个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer, SP)，和一个较短且Tm 值较低的随机简并(arbitrarydegenerate,AD)引物组合，通过3 轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR 扩增，获得已知序列的侧翼序列 利用TAIL-PCR 对小麦抗叶锈病基因同源序列RGA1 侧翼序列的扩增，将RGA1 序列有效延伸至915 bp，为克隆目的基因Lr35 奠定了基础。陈军营等(2007)在前人的基础上，省去第1 次TAIL-PCR 前的l0 个低严谨度的PCR 循环，成功地从小麦基因组DNA 中克隆到全长为748 bp 的小麦GLP3 基因的上游侧翼序列。李丕顺等(2008)以红莲型水稻不育系粤秦A (YTA)线粒体DNA 为模板，在具有细胞质遗传的线粒体特异性片段HL-sp 侧翼各设计3 条特异性巢式引物，通过扩增和序列分析得到了HL-sp5 侧翼l 456 bp 和3 侧翼2 570 bp 的序列。 随着分子生物学理论和应用研究的日益发展，自1983 年获取第一株转基因植株以来植物基因工程日新月异。目的基因的分离和克隆是植物基因工程的第一步。TAIL-PCR 技术以其自身的优点和进步在植物基因的分离和克隆中日趋显示出它的作用，随着TAIL-PCR 技术不断改进和完善，优化条件下效率及特异性的提高，相信TAIL-PCR