扩增未知序列DNA片段的PCR技术研究进展.pdfVIP

《生物工程进展》200 1 ,Vol . 2 1 ,No . 1 扩增未知序列 DNA 片段的 PCR 技术研究进展 王景雪 　孙 　毅 梁爱华 　 ( 山西省农业生物技术研究中心　03003 1) ( 山西大学生物工程室 　030006) 摘要 　1985 年 ,Mullis 等人发明了 PCR 技术 ,短短十余年间 ,这一技术得到迅速发展和应用 , 已由 扩增已知基因发展到扩增未知基因。本文旨在介绍利用 PCR 技术扩增未知序列DNA 片段的最新 进展及这些技术在基因克隆研究中的应用 。 关键词 　PCR 技术 　未知序列 DNA 片段 　基因克隆 　　1985 年 ,美国 P Ecet us 公司人类遗传研究室的 链式反应 ,即 PCR 技术 。这一技术一经发明便得到 Mullis 等人发明了体外无限扩增核酸片段的聚合酶 了迅速发展并带动了生物学研究领域的巨大变革 , 图 1 　UTPCR 方法示意图 5 1 图2 　反向 PCR 示意图 在短短的十余年间 , PCR 及其相关技术的发展与应 U TPCR 的基本原理是首先将两条变性的单链 用的速度已经是没有其它任何一种技术能够与之相 DNA 的 3 ′端加上同样的特殊引物接头 ,使其具有相 比。目前 ,PCR 技术已在众多的研究领域得到广泛 同的末端序列 ,然后以DNA 单链为模板 ,接头的主 应用 ,如在基因克隆、基因定点突变 、cDNA 文库构 体部分为引物 ,进行 PCR 扩增得到目的DNA 片段 。 建 、基因测序 、载体构建以及人类基因组计划等方面 其具体方法 :将一条具有回文结构的特殊引物接头 , 发挥着重要作用[ 1 - 4 ] 。在今天的“基因大战”中 ,新 加在待扩增的单链 DNA 片段 3 ′端 ,然后以其为模 基因的发现与克隆已成为研究的热点 。而扩增未知 板 , 以该引物接头的 5′端主体部分为引物 ,合成它 序列的 PCR 技术格外引人注 目,许多新方法应运而 们的互补链 ,再通过变性 、复性 ,使新合成的两条链 生 ,本文旨在介绍这方面的研究进展 。 复性 。并在 DNA 聚合酶作用下补平 ,产生两端都 含有所连接引物 5′端同一主体序列的模板分子 ,然 1 　PCR 新技术研究进展 后再用该主体序列作引物进行 PCR 反应 , 即可使未 经典的 PCR 技术是以待扩增基因两端 20bp 左 知序列的基因片段得以扩增[5 ] 。 右的核苷酸序列为引物 ,在 Taq DNA 聚合酶的作用 其过程如图 1 所示 。 下 ,进行 DNA 的体外扩增 。因此它是以已知基因 12 　反向 PCR ( Rever se PCR) 序列为前提的 ,然而在现今的基因克隆中常遇到基 基本原理 :用反向的互补引物来扩增两引物之 因序列未知的情况 。为此研究者发展了一系列的扩 外的DNA 片段 。首先用限制性内切酶切割靶 DNA 增未知序列的 PCR 技术 。现分述如下 。 片段 ,并用连接酶 , 使酶切所得 DNA 片段 自身环 11 　同端化 PCR ( U TRCR) , ( U niformed terminal 化 ,然后再用内切酶消化核心区 ,并以该内切酶切点 PCR) 。