新型亲和色谱固定相的制备和性能评价.pdfVIP

摘 要 随着科学技术的发展，特别是生命科学的飞速发展，对分离分析技术提出了更高要 求，要求亲和色谱具有更高的分辨率、更快的分离速度。当以传统软质凝胶作为亲和色 谱载体时，出现了“停滞流动相传质”的问题，色谱峰形较宽，分离时间较长。为解决 这一问题，研究者提出了在亲和色谱中使用无孔载体的设想。由于载体表面无孔，缩短 了生物大分子与载体之间的传质时间，从而缩短了分析时间；同时载体的机械强度大大 增加，适用于高压下进行操作。 在查阅、分析和总结国内外无孔载体发展现状的基础上，选择无孔脲醛树脂一二氧 化锆复合微球作为亲和色谱载体，在吸取雷妹蕾制备经验的基础上，制备复合微球，并 将其用作固定化金属离子亲和色谱固定相和染料配体亲和色谱固定相。具体工作如下： 1．合成了亚氨基二乙酸键合的固定化金属离子亲和色谱固定相，用环氧氯丙烷将基 体活化后，在碱性条件下与IDA键合。将固定相装填到色谱柱后，得到未螯合金属离子 白蛋白和溶菌酶为测试样品，考察了两种蛋白在不同pH流动相色谱条件下在三种固定 相上保留时间的变化情况，同时考察了流动相中盐离子浓度对蛋白质在未螯合金属离子 和螯合Cu2+的固定相上保留时间的影响。结果表明：螯合金属离子后，固定相保留了螯 合金属前的性能，但也出现了与螯合金属前不同的情况，未螯合金属离子时，蛋白的保 留主要依靠配体离子与蛋白质之问的静电作用，螯合金属离子后，蛋白的保留是配体离 子与蛋白质之间的静电作用以及蛋白质与固定金属离子之间配位作用共同作用的结果； 当流动相中加入盐离子后，蛋白质的保留时间随着盐浓度的增加而减小，其作用规律可 用经验公式描述。 2．合成了活性艳蓝X-BR键合的染料配体固定相，利用复合微球表面的酰胺键与染 料分子中的活泼氯原子的在碱性条件下的反应得到固定相。研究了固定相对BSA静态 吸附的动力学性能。结果表明BSA在等电点处吸附量达到最大，其饱和吸附量为 的吸附和脱附速度较传统多孔载体快，充分体现了无孔载体的特性。并根据静态吸附的 结果，通过改变流动相pH、离子强度对BSA进行洗脱。实验结果表明：对实验制备的 固定相，通过改变离子强度进行洗脱更有效。 3．建立了BSA染料亲和吸附的空间质量模型，通过实验数据的拟合，得到了BSA 吸附平衡常数Ka、蛋白与配体的结合数量n以及空间因子s三个参数。通过模型的建 立确证了染料配体亲和吸附属于中等强度的吸附，可用常规方法进行洗脱，模型结果还 体现了无孔载体的特点。 关键词：固定化金属离子亲和色谱；染料配体亲和色谱；牛血清白蛋白；溶菌酶； 亚氨基二乙酸；活性艳蓝X-BR；空间质量作用模型 Abstract and the oflife Withthe ofscience development technology,especiallyrapidlydevelopment made onthe of and sciences，peoplehigherrequests technologyseparationanalysis，the was tohave resolution，faster affinitychromatographyrequired hiigher separationvelocity． VvlIIcnthetraditionalsoft wereusedasthematrixin gels affinity mobile mass ofthe of“stagnant shape question phase transfer’appeared,thepeak was timewas solvethis chromatogramswide，t