第十五章 DNA重组与基因工程.docVIP

第十章DNA重组与基因工程 教学基本要求 描述几个基本概念：DNA克隆、限制性核酸内切酶、基因载体、cDNA文库、基因组DNA文库、聚合酶链反应。 掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程。 了解重组DNA技术与分子医学的关系。 教材内容精要 (一)基本概念 DNA克隆(DNA cloning):应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：存在与细菌体内，识别DNA基因载体(gene vector)：是为携带感兴趣的外源基因，实现外源基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用克隆载体质粒DNA、噬菌体DAN、病毒DAN。 cDNA文库(cDNA library)以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(complementary DNA,cDNA)再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了细胞所表达的基因信息，称cDNA文库。 基因组DNA文库(genomec DNA library):利用限制性核酸内切酶将或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了基因组DNA信息称基因组DNA文库。 聚合酶链反应：简称PCR(rolymerase chain reaction)是在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别的引物及耐热的DNA聚合酶，经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数形式合成的过程。 （二）DNA克隆的基本过程 目的基因的获取：可通过化学合成或PCR的方法获取，也可从基因组DNA文库或cDNA文库筛选。 克隆载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA。 基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与载体DNA进行共价连接形成重组DNA分子。 重组DNA分子导入受体细胞：基因与载体连接成重组DNA分子后，需将其导入受体菌，随受体菌生长、繁殖，重组DNA分子也复制、扩增。导入方法有转化、和感染等。 重组体的筛选：筛选出含重组DNA的受体菌，直接选择法非直接选择法。抗药性标志选择，标志补救及分子杂交属直接选择法；免疫化学法酶联免疫检测法属非直接选择法。 克隆基因的：包括原核表达和真核表达两种体系。可以生成有药用价值的蛋白质或多肽。 【记忆方法】DNA克隆的过程可以简单地概括为五个字来记忆：“分”、“切”、“接”、“转”、“筛”。 分：分离目的基因。 切：对目的基因和载体进行适当切割，便于二者的连接。 接：目的基因和载体进行连接。 转：重组DNA转入受体菌。 筛：筛选出含重组DNA的受体菌。 （三）重组DNA技术与分子医学的关系 现代分子医学是重组DNA技术及其他分子遗传学技术、理论与医学实践相结合的结果。分子医学包含以下内容：疾病基因的发现、发展新药物、DNA诊断、基因治疗及遗传病的防治。 典型试题分析 A型题 1.确切地讲，cDNA文库包含(1999年生化试题) A.一个物种的全部基因信息B.一个物种的全部mRNA C.一个生物体或细胞的全部基因信息D.一个生物体或细胞的全部mRNA信息答案E 【评析本题考点：cDNA文库的概念。 cDNA文库制作的第一步是提取或细胞的总mRNA，然后以mR为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的cDNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库，因此cDNA文库包含一个生物体或细胞所表达的全部mRNA信息。 2.利用聚合酶链反应扩增特异DNA序列重要原因之一是： A.反应体系内存在特异DNA模板B.反应体系内存在特异RNA模板 C.反应体系内特异DNA引物D.反应体系内存在特异RNA引物答案C 【评析本题考点：聚合酶链反应(PCR)工作原理 PCR操作体系中含有双链模板DNA，热稳定的DNA聚合酶及一对引物。引物时，需考虑使这两条引物分别与模板DNA两条链的3特定序列互补，并恰好使所选择的互补序列分别位于待合成DNA片段的两侧，这样就保证了PCR产物的特异性。 3.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是 A.Eoli表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系D.昆虫表达体系E.哺乳类细胞表达体系 答案E 【评析本题考点：克隆基因的表达。 采用重组DNA技术可对克隆基因进行表达，实现生命科学研究、药用、医或商业目的。表达体系分两类：原核体系和真核体系。原核体系缺乏对表达的加工与修饰，不宜表达真核基因组DNA。利用哺乳类细胞表达体系表达出的蛋白质最接近于人体自然表达的蛋白质，因此本题最佳答案是E。 4.限制