第五章目的基因的获取.pptVIP

第五章 目的基因的获取 第一节 基因组DNA片段化 1. 优点 二、随机片断化 2. 机械切割法 第二节 化学合成目的基因 1. 磷酸二酯法 （2）合成过程 2.亚磷酸三酯法 二、 化学合成DNA片断的组装 （3）连接酶连成完整双链 2. 互补延伸连接法 三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 DNA合成仪 第三节 PCR扩增获得目的基因 以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。 第四节 从基因文库、cDNA文库获取目的基因 2. 构建基因文库的载体选用 3. 基因文库构建的一般步骤 （2）载体与基因组DNA大片段的连接 4. 基因组文库的大小 若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106 克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可 构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所 需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右, 均可满足建库要求。 二、 cDNA文库的构建 4. 构建cDNA文库的一般步骤 （2）mRNA的分离纯化 ② 降解mRNA模板 ③ cDNA第二链合成 去掉发卡结构 b.置换合成法： 原 理： 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链。 c.引导合成法： d.引物-衔接头法 (4)cDNA与载体连接： 5. cDNA文库的大小 1 基因组DNA文库的优点 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 2 cDNA文库的主要优点 ①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ②cDNA文库的筛选比较简单易行。 ③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 ④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 ⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。 3 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。 在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。 四、基因文库的筛选与鉴定 重组体(recombinant，转化子transformant)： 就是掺入或导入外源DNA后获得了新遗传 标志的细菌细胞或其他受体细胞。 （二）基因文库的鉴定 1、限制性核酸内切酶分析 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。 N= ln (1-p) ln (1-f) p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数 N：所需