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抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用 作者：钱玮霖 指导老师：徐前明 （安徽农业大学植保学院 合肥 230061） 摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。水平ywords: applification基于基于基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。 关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验 引言 鸡球虫病，造成大批死亡，死亡率可高达80％，病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元。 因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一特别是在南方地区，由于气温高湿度大，利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分药物的预防和治疗上,卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。 年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。垂直板型电泳槽直流稳压电源水浴锅微量注射器μl、50μl、200μl、1000μl、2000μl），玻璃板吸量管；常头滴管Tris碱：购自北京天庚生物有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂：购自Sigma公司；硫酸铵：HCl ； SDS AP ；β-锍基乙醇 0.1%溴酚蓝TEMED ；甘油考马斯亮蓝重络酸钾溴酚蓝甘油1mL）ormula of 12% separation gel 溶液 体积（ml） 40%Acr-Bis 1.5 1.5mol/L Tris-HCL （pH8.9) 1.25 10%SDS 0.05 TEMED 0.002 去离子水 2.15 10%过硫酸铵 0.05 表2 5%浓缩胶（3ml)配制方案 Tab 2 Formula of 5% concentration gel 溶液 体积（ml） 40%Acr-Bis 0.375 1.5mol/l Tris-HCL（pH6.8) 0.38 10%SDS 0.03 TEMED 0.003 去离子水 2.225 10%过硫酸铵 0.03 （c）样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5～1mg/mL，沸水浴加热3min，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合。 ? 一般加样体积为15μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 （d）电泳 ?将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电压调至50V。待样品进入分离较时，将电压调至90V。当蓝色染料迁移至底部时，将电压调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 （e）染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。 （f）对电泳胶扫描并进行图谱分析。 （5）凝集试验分析纯化后的抗体水平 取均加入0.5ml生理盐水连续倍比稀释吸取11稀释的待检0.05ml加入第1，充分混匀后吸出0.5ml加入第2，混匀，从第2吸出0.5ml加入第3；同