暴露于异丙隆中文蛤差异表达基因的研究.pdfVIP

江苏农业科学 2009年第6期 暴露于异丙隆中文蛤差异表达基因的研究 赵艳景 ，胡 虹 ，王 颖 (1．淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏连云港 222005； 2．连云港中医药高等职业技术学校，江苏连云港222006；3．中国药科大学，江苏南京210009) 摘要：为了研究文蛤经异丙隆处理后引起的细胞基因表达变化，探索文蛤暴露于农药后分子水平上基因的开放、 关闭或表达量的改变，以寻找和发现有价值的指示农药污染的生物标记物基因。在恒定温度 (25℃)条件下驯化文蛤 7d，将驯化后的文蛤分为2组 (每组20个)，给药组文蛤暴露于添加除草剂异丙隆的海水中处理30d，对照组文蛤暴 露于天然海水中处理30d，用酸性酚一硫酸氰胍 一氯仿提取法纯化文蛤鳃总RNA，用4种锚定引物，以总RNA为模板 在反转录酶的作用下合成cDNA第一链 ，以cDNA第一链为模板，在锚定引物和随机引物的作用下连续进行2轮PCR 反应 ，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，银染法显色。对聚丙烯酰胺凝胶电泳显示的差异条带进行回收， 并对差异基因片段进行第2次扩增，经琼脂糖电泳后回收基因片段。结果共得到cDNA扩增片段约400条，其中有6O 余种基因片段的表达发生了明显的差异。在文蛤适应除草剂污染过程中有 12个基因表达上调，有 l1个基因表达下 调，有22个基因片段只在试验组表达，有23个基因片段只在对照组表达。基因差异片段可能与指示农药污染的生物 标记基因的表达有关。 关键词：文蛤；异丙隆；DDRT—PCR；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染；克隆 中图分类号：Q786 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2009J06—0042—05 自20世纪5O年代 以来，随着各国社会生产力和科学技 坏也越来越大，但是很少有人研究它们对海洋软体动物的影 术的迅猛发展，海洋受到了来 自各方面不同程度的污染和破 响。无脊椎动物对农药的抗性已经与某些生物酶标记物直接 坏，日益严重的污染给人类的生存和发展带来了极为不利的 相联系，这些标记酶有混合功能氧化酶活性、谷胱甘肽硫基转 后果。其中，农药污染也是不容忽视的一部分。农药污染主 移酶活性、乙酰胆碱酯酶活性或其他酯酶活性等。水生大型 要来 自森林 、农田等施用的农药，会随水流迁移人海，或逸人 无脊椎动物如软体动物虽然被广泛应用于宏观的生物监测追 大气经搬运而沉降人海，有汞、铜等重金属农药，有机磷农药， 踪系统，但是人们仍然没有在分子水平上充分重视它们在生 百草枯、蔬草灭等除莠剂，滴滴涕、六六六、狄氏剂、艾氏剂、五 物标记研究中的作用。 氯苯酚等有机氯农药，以及多在工业上应用而其性质与有机 在生物标记物的毒理学研究中，不同的毒物或者不同剂 氯农药相似的多氯联苯等。有机氯农药和多氯联苯的性质稳 量的同一毒物，诱发组织细胞及损伤后修复的病理生理过程 定，能在海水中长期残留，对海洋的污染较为严重；并因它们 在分子水平上表现为一些基因的开放、关闭或表达量的改变， 疏水亲油而易富集在生物体 内，对海洋生物危害尤大。 阐明这些差异表达基因的结构与功能对研究毒物对机体的损 尽管农药得到了广泛的应用，并且对海岸生态系统的破 伤机制及防治实践有重要意义…。．然而，在缺乏相关基础研 究资料的情况下，要从细胞 内上万种mRNA分子中鉴别出引 收稿 日期：2009—07—06 起毒物损伤和损伤后修复的重要基因十分困难，而mRNA差 基金项 目：江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放基金 (编号： 异显示技术 (mRNAdifferentialdisplayreversetranscription HS07014)；淮海工学院引进人才科研启动基金 (编号：KQ0701