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CCR3 拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中的作用和机制 中文摘要 CCR3 拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中 的作用和机制 中文摘要 背景与目的 正常角膜的透明性是维持良好视力的重要因素之一。当炎症、外伤、缺氧等因素 破坏了促血管生成因子和抑制血管生成因子之间的平衡，促使血管从角膜缘长入角 膜，是导致视力减退甚至盲目的一个主要原因。目前关于角膜新生血管(CRNV)的发 病机制尚未完全阐明，生长因子、细胞因子、趋化因子等炎症介质发挥的作用一直是 研究关注的重点。 CC 趋化因子受体3 （CCR3 ）是一个G 蛋白偶联受体，主要表达在嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞、Th2 淋巴细胞、肥大细胞及巨噬细胞，其中嗜酸性粒细胞高表达。既 往研究CCR3 的主要功能是募集白细胞（主要是嗜酸性粒细胞和Th 细胞）至炎症部 2 位，参与过敏性疾病（如哮喘）的发病机制。此外，CCR3 也表达于血管内皮细胞， 并参与血管生成。而且CCR3 信号在脉络膜新生血管的发展中发挥了关键作用。并参 与角膜缝线法诱导小鼠角膜新生血管的生长，但CCR3 信号在角膜新生血管中的表达 及具体作用机制仍不明确。 碱烧伤诱导的 CRNV 是一种被普遍认可的角膜新生血管的动物模型。为了明确 CCR3 信号在角膜新生血管中的表达及作用机制，本课题从建立小鼠碱烧伤CRNV 模 型着手，应用Real-time PCR 方法检测CCR3、Eotaxin mRNA 在受损角膜组织中各个 时间点上的表达。应用角膜铺片荧光染色法和流式细胞术观察局部应用CCR3 小分子 拮抗剂SB328437 进行早期干预后，对碱烧伤诱导的CRNV 形成的影响。采用Real-time PCR 和Western blot 法从基因水平及蛋白水平检测并比较SB328437 早期干预后角膜 组织内VEGF 表达的变化，明确CCR3 信号的作用机制。并应用培养的人视网膜血管 内皮细胞株（HREC ），通过细胞增殖实验和管腔形成实验，进一步证实CCR3 信号 在血管发生、发展中的作用，为临床治疗新生血管性眼病提供了一定的理论依据。 I 中文摘要 CCR3 拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中的作用和机制 研究方法 1. BALB/c 小鼠60 只，以碱烧伤诱导CRNV 模型，收集碱烧伤后0 d、2 d 、4 d 、7 d 各时间点的角膜组织，以Real-time PCR 检测碱烧伤诱导小鼠CRNV 过程中角 膜组织内各时间点CCR3、Eotaxin mRNA 的表达。 2. BALB/c 小鼠60 只，随机分为实验组和对照组。碱烧伤后立即予局部点眼干预： 实验组使用1 μmol/ml CCR3 拮抗剂，对照组使用0.2%透明质酸钠，每天3 次， 每次3 μl，共干预1 周。在角膜组织碱烧伤2 周后，大体拍照初步观察两组角膜 新生血管形成情况后处死小鼠并摘除实验眼球，应用角膜铺片CD31 荧光染色法 检测新生血管区域占整个角膜的面积比例，应用流式细胞术检测角膜组织中 CD31 阳性细胞数目，观察CCR3 拮抗剂对碱烧伤CRNV 形成的影响。 3. BALB/c 小鼠60 只，随机分为实验组和对照组：干预方法同前，碱烧伤后4 d， 收集各组角膜组织，应用Real-time PCR 及Western blot 法从基因水平和蛋白水平 检测各组角膜组织中VEGF 的表达。观测CCR3 信号通路与角膜组织内VEGF 表 达的相关性。 4. HREC 细胞铺于96 孔培养板中。随机分为五组，分别以0.1 μmol/ml，0.2 μmol/ml， 0.5 μmol/ml，1 μmol/ml 的CCR3-antagonist 干预，等量的PBS 缓冲液作为对照。 干预24 h 后加入CCK8 细胞增殖检测液，分光光度仪450 nm 波长下检测各孔OD 值。通过OD 值计算和分析CCR3