碱性成纤维生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞的体外分化实验的研究.pdfVIP

碱性成纤维生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞 的体外分化实验研究 摘 要 目的： 通过碱性成纤维生长因子（bFGF ）慢病毒载体感染大鼠骨髓间充干细胞 （rBM-MSCs ），观察 bFGF 基因修饰的 rBM-MSCs 在体外的分化现象，研究 bFGF 基因修饰的 rBM-MSCs 是否具有向血管内皮细胞样细胞分化的倾向性及优越性。 方法： 体外分离、培养并鉴定 rBM-MSCs ，将bFGF 慢病毒载体感染 rBM-MSCs ，通 过 ELSIA 、RT-PCR 等方法检测 bFGF 的表达及分泌；MTT 法检测细胞活力。将 细胞分成正常组（普通的 rBM-MSCs 组）、空对组（不含bFGF 基因含有 GFP 的 慢病毒载体感染组）、目的组（bFGF 基因慢病毒载体感染组），用含有血管内皮生 长因子（VEGF ）的培养液培养28d ，观察细胞形态的改变，采用免疫细胞化学技 术（IHC ）检测细胞表面标记分子CD31、CD34 及Ⅷ因子的表达及 Dil-AC- LDL 吞噬实验等。 结果： 1.第 3 代 rBM-MSCs 表面分子阳性率 CD11b/c ：（14.2±0.7）%，CD34 ：（1.3 ±0.5） %，CD44 ：（97.8±0.9 ）%，CD90 ：（96.9±1.5 ）% 。 2.携带有 GFP 的慢病毒载体感染rBM-MSCs 后, 绿荧光表达率高，细胞传代 后没有减弱，且大部分细胞皆有表达。 3. 目的组能够大量分泌bFGF ，而正常组及空对组分泌较少，其中目的组： (5.500±0.124)µg/ml,空对组：(2.650±0.402)µg/ml,正常组：(2.763±0.253) µg/ml，三 组 bFGF 表达有显著差异（P =0.0000.01 ）。 4. MTT 实验，正常组：0.392±0.189 ；空对组：0.394±0.243 ；目的组：0.398±0.186， 三组 OD 值无明显差异（P=0.8670.05 ）。 5.原代 rBM-MSCs 呈条索状或多角形，分布不均匀；三组细胞诱导后皆表现 为多角形或鹅卵石样，细胞连接紧密，分布均匀，但之间差异不明显。 2 6.诱导后目的组能有效地吞噬 Dil- AC-LDL ，表达荧光，而正常组及空对组只 有微量表达；平均光密度值，目的组: 0.518±0.227,正常组：0.047±0.027，空对组： 0.071±0.019，目的组明显高于其他两组（P=0.0000.01 ）。 7.诱导后目的组能部分表达 CD31、CD34 及Ⅷ因子，而空对组及正常组只能 微弱表达。CD31，目的组：(22.73±5.42)%，正常组：(2.57±1.21)% ,空对组： (7.85±1.83)% ；CD34，目的组：(26.32±3.95)%，正常组：(2.41±0.97)% , 空对组： (8.93±1.37)% ； FⅧ，目的组：(30.34±6.62)%，正常组：(1.97±0.52)%, 空对组： (8.93±17.37)%，目的组的表达明显高于其他两组，有显著差异（P0.01 ）。 结论： 采用密度梯度离心法能获取较纯的 rBM-MSCs ，rBM-MSCs 获得 bFGF 的稳定 遗传后，细胞相对活力没有影响，并能分泌 bFGF ，在VEGF 的诱导下bFGF 基因 修饰的 rBM-MSCs 能够更有效地向血管内皮细胞样细胞分化。 关键词： 碱性成纤维生长因子 大鼠骨髓间充质干细胞 血管内皮细胞 分化 慢病毒载体 3 Exprimental study on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells modified by basic fibroblast growth factor in vitro Abstract