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分离纯培养与接种技术 小组成员 该技术的主要内容介绍 该技术可分为两部分：分别为分离纯培养技术和接种技术 1、分离纯培养技术 含有一种以上的微生物培养物称为混合培养物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养。分离纯化是从混杂的微生物群体中获得微生物单一菌株纯培养，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术 方法的介绍及技术要点 1.分离技术 a、倾注平板法 　　 首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物 分离纯化培养的注意点 (1)、确保实验无菌操作 (2)、平板划线要注意以下几点： a. 平板表面不可有水膜或水滴。 b. 接种环的环要圆滑，环平面与培养基表面之间的夹角要小些，划线时以腕力在培养表面作轻快的滑动，勿使平板表面划破嵌进培养基内，线条间要平行且紧密，但不要重叠。 c. 挑菌量不宜过多，划完一个区后应把环上的残菌烧掉。 接种技术的无菌操作 该技术不同方法的选择及应用 1、接种方面 （1）常用的四种方法 斜面接种法：斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种 液体接种法：多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验 固体接种法：普通斜面和平板接种发酵 穿刺接种法：此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种 * 2、接种技术 接种技术是微生物学研究中最常用的基本操作技术，接种就是利用接种工具在无菌条件下降微生物纯种由一个培养器皿转接到另一个培养容器中，进行所需要的培养 b.涂布平板法 先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落 　　 c、平板划线法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 　 d.稀释摇管法 先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。 2.接种方法 １）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 　　 　　３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少 　　 4 ）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 (3)、在涂布平板法中要注意三角玻璃棒的灭菌及将菌液均匀分散至整个平板表面 （4）、在倾注平板法中摇培养皿时要注意适当用力度及摇的方向有序（前后左右）确保菌悬液和培养基不会沾到培养皿上盖，以防影响培养及观察 （5）培养方面 a.注意培养皿的倒置培养 b.控制好不同的培养基的培养时间和 培养温度 a、大肠杆菌和四联小球菌混合菌液作平板划线分离， 37 ℃培养 24-48 小时 b、需氧培养：将已接种好的培养基（试管或培养皿）直接放入一定温度（如 30 、 37 、 55 ℃）的恒温培养箱内，经 24-48 小时（酵母和霉菌需经 3-5 天）培养，观察结果。 厌氧培养：将已接种好的培养基（试管或培养皿）置于无氧的容器内或培养基表面造成无氧环境，再放入适宜生长的温度中培养，