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生物技术实验 理论讲课的内容 第一部分：生化分离制备的特点及基本原理 第二部分：生物大分子制备方案的设计程序 第三部分：分离纯化技术及其选择 第四部分生物大分子分离制备方案设计举例 第五部分 方案设计与实验研究选题 一、生物制备方案设计线路简介 第三部分生物分离纯化技术及其选择 一、材料的选择 二、细胞破碎 三、提取方法的选择 四、沉淀分离及其应用 五、后期纯化方法的选择与应用 五、纯化方法选择与应用 (一)分离纯化的早期使用方法的选择 (二)分离纯化方法的使用程序及原则 (三)对各步分离纯化方法优劣综合评价 (四)酶的纯化过程记录格式 （五）对制备物均一性的鉴定 (一)分离纯化的早期使用方法的选择 特点： 不要求分辨能力高， 但要求负荷能力大 方法： 萃取、沉淀、吸附 批料离子交换 亲合色谱 (二)分离纯化方法的使用程序原则 根据物质的分配系数、分子量大小、离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素选择不同分离方法。 不能在相同或相似的条件下连续使用同一种分离方法，但当条件改变时，连续使用同一种分离是允许的。 纯化方法顺序先后的安排，还考虑到有利于减少工序，提高效率。 (三)对各步分离纯化方法的综合评价 综合评价中的几个概念 单位的定义 比活力 回收率 提纯倍数 一个好的分离提纯方法应该是提纯倍数和回收率都同时有较大的提高 （四）酶的纯化过程记录格式 (五)对制备物均一性的鉴定 溶解度法 电泳均一性的测定法 高速离心沉降法 色谱法 其它： 核磁共振波谱、质谱，紫外光谱，红外光谱测定，或作高效液相色谱、气相色谱、旋光和熔点等试验， 蛋白质的溶解度曲线 * * 《方案设计与实验研究》 第三部分 生物分离纯化技术及其选择 （续） 文献综述 目标物研究进展 研究目的 材料选择 细胞破碎 建立分析方法 预备实验 固液分离 浓 缩 色谱分离 脱盐冻干 产品分析 沉降 离心 过滤 机械法、物理法 化学法、生物法 沉淀、吸附、超滤 离心浓缩 吸附色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 亲和色谱 疏水色谱 逆流色谱 提 取 溶剂萃取 水相萃取 溶解性能 溶液稳定性 固体稳定性 物理性质 化学性质 生物活性、酶活力、比活 组成和纯度分析 分子量、pI 其它理化性质分析 透析、凝胶过滤 冷冻干燥 ++ ++ + 溶解度法 ++ +++ ++ 膜透析及扩散法 +++ ++ + 沉降法 +++ + +++ ?+++ +++ +++ + +++ +++ 自由溶液电泳 凝胶电泳 等电聚焦电泳 ++ ++ ++ 逆流分配法 + ++ ++ +++ 回收率 + ++ +++ +++ 重现性 +++ ++ +++ + 分辨本领 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 分子筛色谱法 方 法 6、冷冻干燥 444 34 1700 185 170 9.2 0.92 10 5、Sephadex-G100 凝胶过滤（酶峰） 125 36.4 1820 52 364 35 7 5 4、DEAE-离子交换 （透析、浓缩） 3、超滤分离 （截留WM10000） 8.83 55 2730 3.67 11.0 750 3 250 2、铵盐分级沉淀 （30-50%饱和度） 1.00 100 5000 0.416 5 12000 12 1000 1、无细胞提取液 说明 提纯 倍数 产率 % 总活力 u 比活力 u/mgPr 酶浓度 u/ml 蛋白质总量 mg 蛋白质浓度 mg/ml 总体积 ml 分析项目 步 骤