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实验三十六 免疫印迹技术与酶联免疫吸附测定法 一、免疫印迹 实验原理 免疫印迹(western plotting)是一种利用抗体一抗原反应检测 SDS—PAGE 或 IEF 胶上 的单一蛋白带的电泳技术。该方法可确定蛋白带是否为靶蛋白。在免疫印迹实验中，蛋白质 首先从胶上电转移至硝酸纤维素膜(或 PVDF 膜)上，剩余的硝酸纤维素膜用非抗原性蛋白质 饱和(常为 BSA 或脱脂牛奶) 以防止非专一的免疫球蛋白结合于该膜上。然后硝酸纤维素膜 用抗靶蛋白的第一抗体处理，接着用带标记的第二抗体与第一抗体结合，通过该方法，可确 定靶蛋白的存在及其迁移方式。 材料与设备 1.水平或直立电印迹装置，电泳仪，恒温振荡器，滤纸，蛋白质转印膜(硝酸纤维素膜 或 PVDF 膜) ，SDS 一凝胶电泳装置。 2 ．试剂 (1)转移缓冲液(pH8 ．1～8．4) ：2 ．9 g Tris 和 14．5 g 甘氨酸溶解于 500 mL 双蒸水中， 加入 200 mL 甲醇并混合，用双蒸水定容至 1 000 mL，40 ℃保存。 (2)封闭溶液(blocking solution)：5 g 脱脂奶粉溶解于 50 mL TBS 溶液中，用 TBS 定容 至 100 mL，4 ℃保存。该溶液在 l 周内就会降解，因而实验中需要新鲜配制，通过加入 0.02 ％的NaN3 ，作为细菌生长抑制剂可保存更长时间。 (3)10×TBS Tris 缓冲液：12．11 g Tris，87．66 g NaCl 和 39 mL 1 mol ／L HCl 混合于 500mL 双蒸水中，充分混匀后，用 1 mol ／L HCl 调 pH7 ．5，用双蒸水定容至 1 L。实验时用双蒸 水稀释 10 倍。 (4)TTBS 缓冲液：在 TBS 缓冲液中加入 Tween- 20，浓度为 0 ．1％，4 ℃可保存 1 个月。 (5)10×PBS ：称取2 ．0 g KCl，2 ．0 g KH P0 ，21 ．6 g Na HP0 •7H 0 和 80 g NaCl，加 2 4 2 4 2 入 500 mL 双蒸水中混匀，用双蒸水定容至 1 L。实验时用双蒸水稀释 10 倍。 (6)PBS ／EDTA ：取 O ．58 g EDTA 和 10 mL 10×PBS 加入 50 mL 双蒸水中，定容至 100 mL 。 (7)NBT 贮液：将 0 ．5 g NBT(硝基四氮唑蓝)溶解于 10 mL 70％的 DMF(二甲基甲酰 胺),4 ℃保存。 (8) BCIP 贮液：将 0 ．5 g BCIP (broloroindolyl phosphate disodium salt ,磷酸溴氯代吲 哚二钠盐)溶解于 10 mL 100％的DMF ，4 ℃保存。 (9)碱性磷酸酶缓冲液(100 mmol ／L Tris ，100 mmol ／L NaCl ，5 mmol ／L MgCl2 ，pH9· 。)! 分别称取 12．11 g Tris，5 ．84 g NaCl 和 1．02 g MgCl ·6H 0，溶解于 500 mL 双蒸水中，调 2 2 pH9 ．5 。定容至 1 000 mL，4 ℃保存。 (10)针对待分析靶蛋白的特异性第一抗体，用封闭液适当稀释。 ． (11)酶标第二抗体：辣根过氧化酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)标记，本实验用后者。 实验操作 1 ．制备 SDS—PAGE 或 IEF 胶，切记不要污染胶。 2 ．将胶在转移缓冲液中浸30 min 。 3 ．带上手套，按照胶的大小切取一层硝酸纤维素膜和4 层 Whatman 滤纸，在双蒸水表面 将硝酸纤维素膜漂洗 5 min 后，将其浸入水中 2 min 。将硝酸纤维素膜转移至转移缓冲液中 浸润 5 min，同样滤纸也在转移缓冲液浸润。 4 ．按照厂商的操作手册将胶、硝酸纤维素膜和滤纸叠成三明治