微生物来源醛糖还原酶抑制剂N99-253B分析研究.pdf

中文摘要 微生物来源的醛糖还原酶抑制剂 N99—253B的分析研究 摘 要 醛糖还原酶(AR)广泛存在于哺乳动物组织中，是聚醇 通路中的一个关键酶，可催化葡萄糖转化为山梨醇，与白 内障、神经系统障碍、肾病变等糖尿病并发症有密切关系。 大量的动物和临床试验证明，醛糖还原酶抑制剂(A尉) 从病因上提供了糖尿病并发症的治疗方法。 f自然界微生物资源十分丰富，据有关统计，全球微生 物约有lO亿种，现已被人们认识的仅占1％。尤其我国地 域辽阔，自然条件复杂，微生物菌种资源为世界所注目。 而且，微生物本身代谢产物具有多样性，某一个菌的代谢 产物就可达数十或数百乖弦比合成得到的化学物质要新颖 且成本低廉。因此厂)得天独厚的微生物资源为醛糖还原酶 抑制剂的筛选提供了有利的物质来源。 高通量筛选(Hi曲throughputscreening，简称Hts) 技术是近年来伴随着生物化学的发展而形成的一种新型的 创新药物研究技术。／所谓高通量筛选是指那些根据人体内 某些特定的代谢过程为靶点而设计的特异性强、高效快速 的筛选模型乞，利用高通量筛选模型对微生物来源的天然化 合物库进行筛选，开发成新药已有不少成功的实例。 现在已上市的ARI的毒副作用较大，因此很有必要 寻找新的低毒高效的ARI。本文具体阐述了微生物来源的 醛糖还原酶抑制剂N99．253B的高通量筛选、分离纯化和 中文摘要 检测尤其是高效液相分析方法。 厂 f第一部分醛糖还原酶抑制剂N99-253B的筛选、 ＼ 制备和结构确定 1．研究目的： 建立微生物来源的醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选 方法，经筛选找到有抑制活性的发酵液，将该菌株成功保 藏和培养，从发酵液中分离纯化获得高纯度活性化合物并 确定其结构。 2．方法： 2．1高通量筛选方法 用硫酸铵分级沉淀的方法从猪晶状体中提取醛糖还原 酶。筛选模型采用DL．甘油醛作底物，在辅酶NADPH的存 在下，醛糖还原酶催化DL一甘油醛还原为甘油，同时NADPH 转化为NADP+，NADPH的吡啶环在340nm处有特征吸收， 通过测定酶促反应体系340nm处光密度的下降速率，间接 测定醛糖还原酶的活性。 实验观测温度、NADPH浓度、DL．甘油醛浓度、酶浓 度对反应体系的影响，确定最佳值后，用96孑L板测定。 NaPi缓冲液(pH6．2)和适量 样品孔加入：60mmol／L 的酶液共90DI，10¨1样品的甲醇溶液；对照孔加入： 60mmol／L NaPi缓冲液(pH6．2)和适量的酶液共90“1，10pl 甲醇；空白SUJU入：60mmol／L NaPi缓冲液(pH6．2)909l， 10pl甲醇。均在37。C保温15分钟，各孔加入66．6“1 l，2mol／L 36mmo]／L Li，S吼、16．7pl DL一甘油醛和16．7p] 2 中文摘要 1．5mm01／L NADPH开始反应，用Wallac 1420多酶标记数 仪于340nm波长处测定37℃每分钟的光密度减少值 (AOD／min)。 AOD／min(对照I_{AOD／min(样品j 样品抑制率7--． A0D／min(对照)l_{AOD／min(空白} 2．2微生物来源的AR]的筛选 从新疆、云南土壤中分离得到的放线菌N98．1～2141 和N99．1．500，经斜面转移、46号和48号两种培养基发 酵，得到5282种发酵液。每种发酵液加等体积的乙醇浸 泡，离心，取上清蒸干乙醇，用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯 提取物作为筛选用样品。 2．3微生物来源的ARI筛选通