抗戊型肝炎病毒结构蛋白多克隆抗体的制备.pdfVIP

· 浙江省医学科学院学报2009年3月(总第76期) 32· · 短篇报道 · 抗戊型肝炎病毒结构蛋白多克隆抗体的制备 吴海波 杨连华 陶薇 沃恩康 王怡婷 洪艳 陈勇 戊型肝炎是 由戊型肝炎病毒 (Hepatitis 4只，由浙江省实验动物中心提供，并在动物 EVirus，HEV)EJI起 的病毒性肝炎 ，该疾病主 免疫后负责在清洁级环境中饲养。 要经肠道传播，广泛流行于亚、非及美洲一些 1-3抗原的纯化 国家，发病例呈全球性分布，是发展中国家较 参照文献嘲，进行重组蛋 白的表达及纯 常见的传染病，我国为高发区，人群感染率达 化，纯化后的抗原冷冻干燥机冻干后长期保 l7．2％，且呈上升趋势1-【2]。近年的研究发现， 存。 HEV在非人灵长类动物、啮齿类动物、猪、 1．4兔源多克隆抗体的制备 牛、羊、鸡等其他动物中广泛分布和传播，具 表达 产物进 行 的 SDS—PAGE后 ，用 有了人畜共患病的特征，动物可将 HEV传染 0．5mol／LKC1染色，切胶 回收含抗原的条带， 给人类，因此，该病已经成为预防医学和公共 加入 2mL的0．9％NaCl，研磨后颈背部皮下 卫生学领域的热点之一刚 。本研究 以原核表 多点注射新西兰白兔，4次免疫，每次免疫抗 达重组蛋白OR 3为抗原圈(重组蛋白ORF23 原量依次为 1001~g、200v~g、300l~g、4001．tg，每 包含了戊型肝炎病毒结构蛋 白ORF2片段和 次间隔 14天 。末次免疫 7天后进行耳静脉 ORF3全片段)，用该抗原免疫了新西兰大 白 采血 ，分离血清测定效价 ，EUSA效价达 1： 兔，制备抗戊型肝炎结构蛋 白的兔源多克隆， 100000以上，麻醉兔子，采血后分离血清，保 并对其进行初步纯化 ，测定其效价 ，获得了较 存于一20℃。 为满意的结果，现报道如下。 1．5效价和浓度测定 1材料与方法 参照文献昀，用纯化获得 的抗原进行 间 1．1仪器与试剂 接 ELISA方法的建立 ，血清经稀释后 ，加到 酶标仪为美 国宝特Bio-Tek产品，蛋白 包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后 ，再加 电泳仪为Bio—Rad产品、超速冷冻离心机、高 入 HRP标记的羊抗兔IgG，间接 ELISA进行 速离心机均为Beckman产品、紫外／可见光分 效价测定。设阳性对照，阴性对照(以同等稀 光光度计为Eppendorf产品、低温冷冻干燥 释度的无免疫兔血清)和空白对照。判定结 仪为Heto产品。HRP羊抗兔酶标二抗购 自 果为，OD值大于等于阴性对照的2．1倍为阳 Sigma公司，NC膜购 自Millipore，TMB购 自 性。 上海生工，ELISA板购自广州杰特，其他试剂 采用辛酸一饱和硫酸铵沉淀法纯化多克 均为国产分析纯 。 ． 隆抗体。采用紫外，可见光分光光度计，对抗 1．2实验动物 体进行浓度测定。采用建立的间接 ELISA 清洁级新西兰大白兔每只约3kg，雄性， 方法对纯化前后的多克隆抗体的效价进行 基金项 目：浙江省医学科学院青年基金项 目资助 (A40706Q) 作者单位：3l0ol3，杭州 ，浙江省医学科学 院生物工程研究所 浙江省医学科学 院学报 2009年3月(总第 76期) · 33· 测定。