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我的载体构建心得 aqi96 构建载体花了我3 个月的时间，真是折磨人，幸好我的心态好。如果你要问为什么构 建个载体会花这么长的时间，确实，对于一个熟悉分子生物学技术的人来说，应该2-3 周就 差不多了。花这么长时间，首先因为我在试验方面完全是个新手，以前搞临床几年了，现在 读专业型的硕士学位，在学校读分子生物学时就是朦朦胧胧的，基础比较差。其次在做实验 时没有特别懂得、专门的人来带我，所以在做的过程中充满了艰辛。现在终于构建成功了， 总算舒了一口气，不过后面的路还长，据说更难，走一步算一步吧。把我构建载体的过程及 出现的问题写出来，希望能给像我这样的战友一些启示，祝大家早日把试验做成功。 一、PCR 过程中的经验教训 做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完 全一致才行，所以在PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片 段较长的时候更是如此。这样才能在PCR 过程中减少错配情况。高保真酶常常对 退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是Tm-5 度，但如NEB 的高保真酶 的退火温度是Tm 值+3 度。PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。我就曾经用普通的 酶进行过PCR ，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配， 而且每次都不一样。 二、PCR 产物直接酶切后连接不成功 当你获得PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收 的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。但往往会出现连接不成功的，原因 以PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。因为这个时 候PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就 赶紧做个T-A 克隆吧 三、T-A 克隆应注意的问题 T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题 要注意的。T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一 个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。但要注意，首 先是T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的T 载体，这样会切成 多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。其次，因为在PCR 产物是用高 保真酶扩增的，所以首先要进行加A 反应。这时候应购买T-A 快速克隆平末端加 A 试剂盒。进行加A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。我 开始就是这样，想着节约，说明书写的是PCR 产物加 15ul,我没舍得，加了3ul,加 A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。后来我PCR 产物加为 6ul,就成 功了，屡试不爽。最后，在连接产物加入感受态细胞后，轻弹混匀，稍微离心一 下，不要剧烈的震荡，反正我失败的时候都是力度较大，也不知道有没有关系。 四、菌液PCR T-A 克隆成功后，你可以看到很多蓝白斑，一般来说蓝斑要比白斑稍多。不是 每个白斑都是你要的东西，下面就是阳性克隆的筛选了。挑白斑到摇菌管过夜摇 菌，然后进行菌液PCR 。关于菌液PCR 引物的问题，有的人用克隆引物，有的人 用专门设计的检测引物，两者我都用过，只要检测引物能P 出来，克隆引物也能P 出来，完全符合，所以一般的时候用克隆引物就可以了，除非运气不好，真好在 起始点就出现错配的情况。 五、碱法小提质粒 挑取阳性克隆的菌液，抽提质粒吧。既然是小提，就不要很多菌液，一管就 够了，3-5 毫升，开始以为菌液越多越好，其实是错的，首先这点菌液提的质粒够 你测序及酶切用了，其次加多了反而不好，因为加的裂解液是相对固定的，多了