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实验40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定 ? 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。 一、过氧化氢含量的测定 【原理】 H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。 【仪器和用具】 研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。 【试剂】 100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。 【方法】 1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。 表40-1 测定H2O2浓度标准曲线配置表 试剂（ml） 离 心 管 号 1 2 3 4 5 6 7 100μmol/L H2O2 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4℃下预冷丙酮 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5%硫酸钛 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 浓氨水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 ? 3000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀 2mol 硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。 2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。 3.结果计算： 植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)= 式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）； Vt—样品提取液总体积（ml）； V1—测定时用样品提取液体积（ml）； FW—植物组织鲜重（g）。 二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法 【原理】 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 ? ? R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－) ? ? R(Fe+3OH－)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【仪器和用具】 研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。 【试剂】 10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8； 0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定； 0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 ·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 【方法】 1.酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入