实验一质粒DNA的提取.docVIP

实验一 质粒DNA的提取 一、原理 采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、方法 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp））） 氯化钠 3 g 葡萄糖 0.6g 按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH调 pH至7．2～7．4。分装于15ml试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／cm2灭菌20min. l抗菌素： 氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。 五、仪器： 恒温振荡器。 低温冰箱-20℃ 真空泵。 台式高速离心机 六、说明 1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯 梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理 和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐 等。 2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它 的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；作中的EDTA是二价离子 Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅 助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。 3、TENS中NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定，怛当pH大于12或小于3 时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，因而 使染色体DNA与质粒DNA变性。 TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与 蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合 成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核 糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用 Rnase去除RNA时)受干扰。 4、3．0mol／L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA 能够复性，并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构) 而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合物凝聚沉淀。pH5．2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐能与 SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 5．饱和酚：酚是一种表面变性剂，属非极性分子。水是极性分子。当蛋白质溶液与酚混合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心。变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，酚比重更大，保留在最下层。酚作为变性剂．也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失，(2)酚很容易氧化，变成粉红色，氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris—HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。饱和酚中加上8一羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由于有颜色．溶解在酚中后，使酚带上 颜色，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。 6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：