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黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的优化 学生姓名: 方三秀 学 号: 指导老师: 李敏 专 业: 生物技术 二○一○年九月十日 摘 要 通过摇瓶培养实验,对酶黑曲霉A3生长曲线进行了初步摸索,并进一步对其产CMC 酶活的液体发酵的最适培养基和培养条件进行了初步探讨。 关键词： 黑曲霉；CM-纤维素酶；液体发酵 绪 论 纤维素是自然界中最丰富的生物资源, 但纤维素大部分难以被人类或动物 利用, 如利用纤维素酶将纤维素降解成可被人类利用的糖无疑是开辟了一个新 [1] 的能源来源 。纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称，应用极其广泛，如 酿造果汁与蔬菜加工，粮食加工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分的提 [2] 取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面 。纤维素 酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，但研究和生产 中所用的纤维素酶都是用真菌发酵得到的，菌种大多是木霉、曲霉和青霉、根 霉属和漆斑霉属等。而黑曲霉是公认安全(GRAS)的微生物，用其生产酶制剂安 全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性，可望 用于食品和医药等领域。故希望通过对黑曲霉A3 产纤维素酶的液体发酵产酶条 件的优化，以获得酶的高产量，为纤维素酶的生产应用奠定基础。 1． 材料与方法 1.1 菌种 黑曲霉A3(Aspergillus niger A3)：当地采取。 1.2 培养基及培养条件 [3] 1.2.1 营养盐液Mandels 氏营养盐液 ，再加入NaNO3 4.0 g/L。 1.2.2 斜面培养基(1)菌种保藏培养基(g/L)：麸皮5，蛋白胨1，琼脂20，用 营养盐液配制；(2)产孢子培养基：PDA 培养基。 [4] 1.2.3 发酵产酶基础培养基产纤维素酶基础培养基(g/L) ：玉米芯80，用改 良 Mandels 氏营养盐液配制，250 mL 三角瓶30 mL 装液量，起始pH5.5～6.0。 上述所有培养基均在1.0×105 Pa、121 ℃灭菌30 min。 1.2.4 斜面培养将接种后的斜面于28 ℃培养4～5 d。 1.2.5 摇瓶发酵产酶培养将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制备成孢子悬 液， 接种3 mL(1.2×108 个孢子)到发酵培养基中，于28 ℃、200 r/min 振荡 培养。 1.3 测试及计算方法 1.3.1 酶活力的测定方法CM-纤维素酶活力的测定：取适当稀释的粗酶液0.1 mL，加到1 mL、1%的羧甲基纤维素钠悬浮液中(pH4.6，0.2 mol/L醋酸缓冲液配 制)于50 ℃水浴反应10 min，用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法，测定产生的还原 糖。 以木葡萄糖为标准，在本实验条件下，每min 产生1 μ mol 还原糖所需的酶[5- 6] 。 定义为1 个酶活力单位(IU/mL)。 1.3.2 pH 值的测定采用国产精密pH 试纸和pHs-25 型酸度计。 2 结果 2.1 产纤维素酶发酵特性研究 为了对黑曲霉产纤维素酶的发酵条件进行研究，首先对其发酵产纤维素酶 的特性进行了考察。实验按25 g/L 的浓度加入麦秸粉、甘蔗渣和玉米芯等不同 碳源，用营养盐液配制250 mL 三角瓶装液量30 mL，在28 ℃、200 r/min 振荡 培养，每隔24 h 取样测定纤维素酶的活力，结果见表1。 表1 黑曲霉A3 产纤维素酶发酵时间与酶活的关系 不同发酵时间的相对酶活力/% 碳源(25 g/L)