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第九章 分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总D NA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探 针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来 发展了许多非同位素标记探针的方法。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克 隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它 不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 第一节 核酸探针标记的方法 核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射 性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况, 可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 DNA DNA 一、双链DDNNAA探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。 双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。 1. (nicktranslation) 1. (nicktranslation) 11.. 切口平移法((nniicckkttrraannssllaattiioonn)) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就 可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从5→3的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷 酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代 替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核 苷酸。切口平移反应受几种因素的影响:(a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP 的比活性和模板中核苷酸被 置换的程度。(b)DNA 酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c)DNA 模板中的 抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。 材料： 待标记的DNA。 设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂： (1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/LTris·Cl(pH7.2);0.1mol/LMgSO4 ;10mmol/LDTT; 100μg/ml BSA。 (2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/LTris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。 (3)[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP:400Ci/mmol,10μCi/μl。 (4)E.coliDNA聚合酶Ⅰ(4 单位/μl):溶于50μg/ml BSA,1mmol/LDTT, 50%甘油，50mmol/LTris·Cl (pH7.5)中。 (5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。 (6)EDTA:200mmol/L(pH8.0)。 (7)10mol/LNH4Ac。 操作步骤:::: (1) 按下列配比混合: 未标记的dNTP10μl 10×切口平移缓冲液 5μl 待标记的DNA1μg [α-32P]dCTP或dATP(70μCi)7μl E.coliDNA聚合酶 4单位 DAN 酶 I1μl 加水至终体积 50μl (2) 置于15℃水浴60分钟。 (3) 加入5μlEDTA 终止反应。 (4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。 [[[注意]] 1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32P]-dNTP。[ ]] 2、DNA酶Ⅰ