PCR的故事－深大研究生课件081012_杜金伟.ppt

PCR的故事polymerase chain reaction 杜金伟 2008.10.12 主要内容 PCR其人其事 PCR引物设计原则 如何提高PCR特异性 PCR基本类型 一、 PCR其人其事 三者有何关联？ 同年8月，Mullis首次在公司里正式作了有关PCR原理的报告，听者反应冷淡。因为原理太简单了，如果可行别人早就做过了。 1985年初，技术精湛的日裔技术员Randall Saiki加入PCR试验工作，取得理想结果。 1986年5月，Mullis在大会上报告PCR技术。同年6月Saiki首次将嗜热菌中分离出来的耐高温Taq DNA聚合酶用于PCR，效果惊人。自此PCR取得完全成功。 PCR原理 Step1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 Step2. 退火：溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 Step3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 One sentence One makes two, two make four, four make anything 二、 PCR引物设计原则 引 物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物设计的原则 ①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 ⑦引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 三、 提高PCR特异性 1. 引物设计 最关键的一步 （1)典型的引物18到24个核苷酸长，引物需要足够长，保证序列独特性 。 但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 (2)选择GC含量为40％到60％含量的引物。 (3)设计5‘端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 (4)避免引物对3‘末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 (5)避免3‘末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 (6)避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 2. 引物退火温度 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。 3. 引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 4.镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。 最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。 较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。