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基因表达干扰技术 华大基因 杨旭 基因表达干扰技术 一、反义核酸技术 一、反义核酸技术 （一）反义寡核苷酸技术 1.反义寡核苷酸的作用机制 (1) 抑制mRNA的翻译：杂化体激活RNase H，降解mRNA (2) 抑制复制或转录：竞争性结合转录因子，空间位阻 (3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达：aptamer式连接 一、反义核酸技术 2、反义寡核苷酸的设计与合成 1）设计 ① 计算机软件预测RNA的二级结构 ② 利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计 一、反义核酸技术 2）合成 ① 长度一般为15～25个核苷酸： 太长很难进入 太短特异性差 18个 ② G-C含量为60%～65% 一、反义核酸技术 3.反义寡核苷酸的修饰： 分子量小，磷酸二酯键是核酸酶所用的化学键，在自然状态下ASON是RNA酶的激活剂 最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰 （1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子：具毒性，采用嵌合体 （2）甲基修饰磷酸骨架：价格昂贵 （3）聚酰胺键代替磷酸骨架：保留碱基结构，戊糖和磷酸残基变成线性的酰胺结构，增加对目的序列的亲和力，提高对核酸酶的耐受力和细胞吸收的效率。 一、反义核酸技术 4.反义寡核苷酸的给药途径 （1）直接作用于培养细胞：吞噬作用 （2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞 （3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径 对实验动物产生一定毒性 （二）反义RNA技术 1.反义RNA的作用机制 (1) DNA复制水平：抑制DNA复制，与引物RNA前体互补结合 (2) 转录后水平： 与mRNA5`端互补，影响其加帽 与mRNA前体的外显子和内含子连接区互补结合，影响前mRNA剪接 作用于多聚腺嘌呤形成位点，阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运 (3) 翻译水平：抑制mRNA翻译 与目的mRNA5`非翻译区SD序列结合 与目的mRNA5`编码区AUG互补，抑制翻译起始 与编码区结合，使mRNA构象改变，阻止mRNA在多聚核糖体上翻译 (4) 使mRNA更易被核酸酶识别而降解 一、反义核酸技术 2.反义RNA的设计 与ASON相比，反义RNA的设计较为简单 mRNA为模板合成互补配对的双链DNA，反向插入载体，导入细胞表达，得到与目的基因互补的反义基因序列。 （三）反义核酸技术的应用 细胞水平、动物水平就治疗肿瘤、哮喘、高血压和AS等疾病取得了令人兴奋的结果。 需要完善或解决的问题： ①防止被核酸酶降解 ②孵育只有少量能进入细胞，需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制 ③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合 ④ASON是否与人类正常基因组存在同源序列，是否会影响正常细胞的基因表达 ⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题 二、核酶与脱氧核酶 二、核酶与脱氧核酶 （一）核酶 1.核酶的分类 （1）大分子核酶：几百到几千个核苷酸 第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子的区分：10-12bp的中心核心结构（保守序列） RNase P：核酸内切酶 参与加工tRNA的初始转录产物，所有的tRNA5`末端都由该酶催化产生。 （2）小分子核酶 ：35-155个核苷酸 锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和 neurospora Varkud satellite （VS）核酶 二、核酶与脱氧核酶 2.核酶的结构 （1）锤头状核酶： 二级结构有三个 螺旋环结构区和 一个催化中心（C3-A9） I，II螺旋和底物RNA结合 NUH三联体3`末端-剪切位点 H为除G以外的任一核苷酸 二、核酶与脱氧核酶 （2）发夹形核酶：约50个核苷酸 每个结构域由螺旋-环-螺旋组成 催化连接反应的活性比催化切割反应的活性要高近10倍，锤头状核酶相反（100倍） 剪切位点：底物环5的N与G之间 二、核酶与脱氧核酶 （二）脱氧核酶 1.脱氧核酶的结构种类及特征 （1）10-23型脱氧核酶：15个核苷酸环状催化中心，2侧8个脱氧核苷酸的底物识别部位。 切割位点是底物RNA的嘌呤-嘧啶连接处。 二、核酶与脱氧核酶 （2）8-17型脱氧核酶：催化中心：13个脱氧核苷酸， 切割