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第十章 测序技术 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主 要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二 种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产 生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE 胶上电泳进行检测，从而获得D NA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种 链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷 酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基 团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种d NTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的 起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可 用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 第一节 非同位素银染测序系统操作技术 一、概述： Promega公司的SILVERSEQUENCETMDNA 测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏 的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测 序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVERSEQUENCETM系统用未修饰的5OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。 该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也 不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。 Taq DNA 聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚 合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景 低。 SILVERSEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deazadGTP，或dITP)替代dG TP可清除由GC 丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的 严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延 伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶 解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于 有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC 含量 高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，24mer 的GC 含量约为50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA 产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助 于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DN A模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。 二、材料 待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。 三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。 四、试剂 （1）SILVERSEQUENCETMDNA测序试剂盒。 （2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰 胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm 过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置 于4℃冰箱可保存2周。 （3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。 （4）10×TBE缓冲液（1mol/LTris,