成像流式细胞仪原理与应用.docxVIP

二代流式技术产品-成像流式细胞分析邱又彬MerckMillipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速细胞成像系统ImageStreamX Mark II。这是第三代ImageStream成像流式细胞仪，具有无与伦比的细胞分析能力。显微镜可提供详细的细胞图像和形态信息，是研究细胞功能的重要工具。然而，显微图像的解释却是主观、定性且费力的。流式细胞仪擅长定量的表型分析，可产生统计学上可靠的结果，不过，流式细胞仪却缺乏成像能力，因此无法了解亚细胞定位。ImageStream系列开创性地将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息。ImageStreamX Mark II能实时捕获每个流动细胞最多12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。ImageStreamX Mark II的这些功能可以对细胞形态、荧光探针的强度和定位进行检测，进而为科学家提供广泛的图像分析应用，包括细胞间相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形态变化等。ImageStreamX Mark II的特征如下：?速度更快：Mark II对进样速度进行了提升，每秒可以分析多达5000个细胞，简单易用的补偿向导可以指导您轻松完成多色补偿运算。?操作更简单：全新而直观的用户界面提供了每一个细胞的图像及实时绘图相关的图形化控件。?样品适应性更强：Mark II可选配7个激光；样品容量20-200 μl，增加了实验的灵活性，适用于多用户实验室。?样品利用率更高：Mark II将样品利用率提高到了95%，更适用于稀有的细胞样品，而且未使用的样品也可回收用于进一步分析。从2005年开始，Amnis量化成像流式分析仪被广泛应用于各个研究领域。其中超过300篇的文章发表在高水平的同行评议杂志（peer-reviewed journal）上。这些研究领域包括生物化学、药物研发、血液、免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis与众不同的实验理念和卓越性能，使得这个名单不断变长。生物化学：经典的生物化学技术主要用于分子定位和共定位检测，这非常适合使用Amnis量化成像流式分析系统，比如转录因子从细胞质到细胞核的转位、分子在亚细胞器间的运输、蛋白质在细胞内和细胞间的共定位。它可以获取复杂样品每个细胞中探针定位和共定位的统计学结果，这对于传统生物化学研究是极大的补充和拓展。示例1：T细胞-抗原递呈细胞中NF-κB的转运：NF-κB在与抗原递呈细胞（APC）和特异性多肽连接的转基因T细胞中从细胞质转位到细胞核的转位。在此使用Similarity参数是指两幅图像间像素信号的相似性，即Similarity值越高代表NF-κB（绿色）和7-AAD染核（红色）信号相似度越高。示例2：抗体-药物耦联复合物与内涵体和溶酶体的共定位：荧光特异性标记的抗体-药物耦联复合物（ADC）通过细胞内吞作用进入细胞后与内涵体和溶酶体的共定位。此处endosome/lysosomecolocalization的衡量是通Bright Detail Similarity参数实现的，它代表的是两幅图像中荧光亮点的位置。示例3：ImageStream系统中利用FRET（荧光能量共振转移）检测蛋白质间的相互作用： FRET（荧光能量共振转移）：在荧光显微镜下可以看到，荧光团可以在吸收一个波长的光之后发射出波长较长的光；当第二个荧光团离第一个荧光团足够近的时候，它就可以从第一荧光团获取能量，发射出波长更长的光。FRET对于荧光团之间的距离很敏感，如果发生了FRET，说明荧光团之间的距离大约是在10 nm。当用两个荧光团分别标记蛋白时，可以通过供体和受体荧光团间的FRET来推断蛋白质间的距离。ImageStream可以定量分析稀有细胞亚群中的FRET，来衡量细胞内蛋白相互作用和细胞间连接。区别胞内发生和未发生FRET蛋白的位置可以改进我们对于信号转导通路的理解。下图所示，受体1和受体2分别用PE（供体）和AF647（受体）标记。收集细胞图片用488 nm激光激发。受刺激的样品中可以检测到AF647荧光团，说明发生了FRET现象。药物研发：药物研发的目标是找到高质量的、可以改善治疗效果的候选药物。利用相关信息分析可以很快的减少候选药物的数量，选出那些既不影响效果又不会引起不可预见的致命后果的候选药物，这会节省药品公司为了淘汰某些候选药物进行临床实验而花费的时间和金钱。Amnis的量化成像流式分析系统的一些应用非常适合鉴定药物的性质，包括细胞信号转导、细胞间相互作用、化学因子诱导的细胞形变、细胞死亡、共定位和吞噬。而且，这些应用非常适于全血白细胞这样的异源、原代细胞