体外冲击波对成人骨髓间充质干细胞中成骨活性因子及MAPK信号通路影响.pdfVIP

中文摘要 体外冲击波对成人骨髓问充质干细胞中成骨活性 因子及MAPK信号通路的影晌 摘 要 目的：在成功体外分离培养人骨髓间充质干细胞 增殖分化及成骨活性因子和酶联信号分子表达的影响，探讨 ESW促进成骨过程中MAPK酶偶联信号通路的状态，为揭 示ESWT治疗成骨障碍性疾病的机理提供理论依据。 方法：自早期成人股骨头坏死(AMH)患者髂骨行骨 髓穿刺抽取骨髓，采用密度梯度离心法提取hMSCs；经体外 培养成功后，应用MTI法测定增殖活力，以确定ESW干预 的合适剂量；施加ESW干预后，分别利用倒置相差显微镜、 HE染色隔代(P1．P11)观察骨髓间充质干细胞形态、贴壁率和 倍增时间等变化，应用酶细胞化学、免疫细胞化学等方法检 测碱性磷酸酶含量、胰岛素样生长因子．I(IGF．i)ffn转化生长 因子．JBl(TGF8，)表达，以及磷酸化细胞外信号调节激酶 干预组pERKla及TGFl31表达变化。对上述各部分实验数据 采用相应的方差分析、配对t检验、X2检验和相关分析，设 定P0．05为有统计学差异。 结果：1体外冲击波对骨髓间充质干细胞的影响显著： 壁、存活和增殖，生长峰值低于对照组。ESW干预体外培养 中文摘要 hMSCs的最佳能量为5kV(100次)。 2原代hMSCs细胞呈圆或扁圆形，48h内陆续沉底贴壁， 7～9d自细胞两极伸出足状的突起，呈短梭形或多角形，胞体 透亮，折光性好；细胞多至瓶底的80％即可消化传代。 3传代细胞经HE染色，胞浆红染，核呈深蓝色，核仁明 显。ESW干预后的P1代hMSCs增殖分裂加快，胞浆丰富， 比值大，增殖高峰提前，细胞簇集融合，呈放射状扩展；P7．P9 代细胞体积增大明显，3—5d即呈条带状交错成片，基质堆积 成束，方向性明显。干预后的Pll代hMSCs仍有核分裂细胞 呈对称分裂，表现出定向成骨分化的潜能；而对照组为不对 称分裂和多种分裂方式，存在多向分化的可能。 4 于对照组(P0．05)；随后两组细胞的贴壁率差异逐渐加大。 细胞倍增时间的变化与贴壁率并不同步：P3代干预组hMSCs 提前进入对数生长期，倍增时间fTd)较对照组缩短1．72d；P5 代干预组Td短于3d，细胞增殖能力最强；随后细胞成骨分 化活跃，以胶原合成为主，核浆比骤减，P7代干预组Td短 于延长至4．45d。与对照组相比，ESW干预明显缩短了hMSCs 的倍增时间(PO．05)。 5对照组碱性磷酸酶(ALP)曲线近似呈S型，有明显的潜 干预组ALP总体水平明显高于对照组俨0．05)。 6ESW干预后的P3代hMSCs胞浆及胞核中出现大量黄 中文摘要 色．棕黄色颗粒，IGF．I阳性率为42．3％，而对照组无明显着 色；P7代干预组细胞呈强阳性，阳性率达87．9％，对照组开 始出现IGF，I染色明显阳性的细胞，较干预组晚4代，约25d。 较晚；ESW干预组P5代仅见个别细胞呈弱阳性表达，P7代 hMSCs胞浆可见均匀、淡染黄色颗粒，P9代TGF．81染色阳 性率为72．2％，个别细胞浆内尚见深染的棕褐色颗粒；随后 阳性率开始下降。对照组始终没有出现明显的阳性表达，两 40d，高峰持续时间短，仅在P9代干预组细胞。 7 hMSCs胞浆内即出现黄染颗粒，pERK】，2弱阳性；对照组仅 pERKl，2活跃，强阳性表达与TGF—B1高峰同代出现；经 (P0．01)，而TGF．B1染色仍呈均匀阳性(P0．05)。 佳能量；ESW干预能够提高hMSCs的贴壁、增殖及成骨活 性，不同程度的促进了成骨活性因子的生成；ESW的骨科生 物学作用可能是通过MAPK酶偶联信号通路实现的，TGF一8， 过程应该还彳j其它成骨活性因子或酶的参与。ESWT联合骨 髓间充质于细胞移植将在临床治疗骨肌系统慢性损伤性疾 病中发挥更为积极而广泛的作用。 中文摘要 关键词：体外冲击波；骨髓间充质干细胞；增殖；分化； 胰岛素样生长因子一I；转化生长因子一B；丝裂原活化蛋白激 酶；细胞外信号调节激酶 英文摘要 Effect