人胰岛素原基因非β细胞表达质粒的构建.pdfVIP

中文摘要 前 言 l型糖尿病是由胰岛13细胞自身免疫性损伤导致的胰岛素绝 对缺乏的一种代谢障碍性疾病。通过基因转移技术将人胰岛素原 基因导入糖尿病患者体内，以产生长期、稳定、按生理模式分泌的 胰岛素，从而达到永久治疗的目的。胰岛13细胞含有特定前激素 转化酶(PC：和PC，)，把人胰岛素原合成为成熟的具有生理活性 的胰岛素A链和B链复合体。为使得非13细胞也获得合成成熟 胰岛素的能力，我们利用非13细胞内普遍表达的furin酶，采用定 点突变技术，在人胰岛素原基因B—C和c—A连接处引入新的裂 解位点，使人胰岛素原成为fiarin酶的底物。从而使非13细胞在转 染突变后的人胰岛素原基因后，能够合成成熟胰岛素并分泌到细 胞外：为基因治疗1型糖尿病提供实验基础。本实验目的是掌握 PCR技术与鉴定方法，构建突变的人胰岛素原基因质粒，为糖尿 病基因治疗提供实验研究基础。 ／材料与方法 f L 1．药品与试剂 人胰岛素原基因质粒；定点突变试剂盒；PCR回收试剂盒 2．仪器 PCR反应仪 3．方法 利用定点突变技术，在人胰岛素原基因B—C和C—A连接处 引入新的裂解位点。 ·1· ①人胰岛素原基因质粒增殖。 ②设计突变所需引物。 ③PcR循环。 ④琼脂糖凝胶电泳，回收③中的3112bp的目的基因片段。 ⑤对目的基因末端平滑及5’端磷酸化处理，用连接酶连接目 的基因。 ⑥连接物转化感受态大肠肝菌HBl01 ⑦选阳性克隆测序。 实验结果 突变的人胰岛素原cDNA测序结果证实在人胰岛素原基因B —C和C—A连接处引入新的裂解位点： 位点I Thr B—C连接处：LysThr地峥ArgLy=趣、 Gin Gln 位点11C—A连接处：kuLvs血g-一Arg Ly=Arg、l ／ 结 论 理论上由单一蛋白质缺乏所致疾病是基因治疗的适应症。在 动物研究方面，许多代谢性疾病可由基因治疗而治愈。1型糖尿 病是由于胰岛13细胞自身免疫损伤而导致胰岛素分泌不足而致， 既然糖尿病是单一蛋白质缺乏，理所当然是基因治疗的适应症。 在真核细胞内蛋白质合成和分泌有两种途径：1、组成型蛋白 细胞含有特定前激素转化酶(PC：和PC，)，合成成熟的胰岛素(A 链和B链复合体)。合成过程中，胰岛素原B与A链间的C肽被 裂解掉，发生在B—C连接处，裂解位置是Arg—Arg碱基；发生在 C—A连接处，裂解位置是Ly=一A唱碱基。 ·2· 在过去的糖尿病基因治疗模型中，人胰岛素原基因转染非B 细胞，其主要表达为胰岛素原和少量成熟胰岛素，且不能分泌至细 胞外。在大多数非B细胞内含有特定的内源性的，依赖于高尔基 器的合成酶furin。虽然furin酶也象PC，和PC，，在二元碱基处裂 解底物，但两者底物是不同的。在非8细胞内不能合成人胰岛 素。 本实验我们的目的是通过某种方法使非13细胞能够产生成 熟胰岛素。为使非13细胞准确高效的合成成熟胰岛素，我们利用 了非B细胞内含有furin酶的特点。采用定点突变技术把fial-in酶 得人胰岛素原成为furin酶的底物，这两个新的裂解位点发生在人 胰岛素原B—C和C—A连接处。