差速离心结合蛋白质组学技术与研究受镉盐胁迫后牙鲆肝差异蛋白质.pdfVIP

第37卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第7期 of ChineseJournal 1019～1024 2009年7月 AnalyticalChemistry 差速离心结合蛋白质组学技术研究 受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质 那宏坤1 黄清育1 黄河清¨’2’3 (厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系‘，近海海洋环境科学国家重点实验室2， 化学化工学院固体表面物理化学国家重点实验室和化学生物学福建省重点实验室3，厦门361005) 摘要人工构建镉盐污染源，选用差速离心结合双向凝胶电泳(2D—PAGE)法，高效提取、分离和筛选牙鲆 (Paralichthysolivaceus，PO)受镉盐胁迫后的肝脏全蛋白和差异蛋白质。实验结果表明：选用直接裂解法提取 liver 牙鲆肝(PO POL)全蛋白质且用2D—PAGE分离，可获得约800个蛋白斑点，其中镉盐诱导了11个差异蛋 mass 可获得牙鲆肝脏受镉盐胁迫后表达的54个差异蛋白质，并适合于用肽质量指纹(peptidefingerprint， PMF)图谱技术鉴定。本实验所建立的差速离心结合蛋白质组学技术可高效提取、分离和鉴定组织全蛋白或 差异蛋白，并能有效地筛选出蛋白指示物。 关键词牙鲆肝，蛋白质组学，差速离心，镉污染，蛋白指示物 1 引 言 建立高效提取与分离动植物及微生物组织细胞中的全蛋白，且可鉴定蛋白质的方法，是目前开展蛋 白质组学研究所面临的技术难题之一【l2 术是目前开展蛋白质组学研究的常用分离技术，但前者易受细胞组织内干扰物影响，例如核酸、多糖和 J。目前，组织细胞全蛋白的常 脂类物质旧1；而后者在分离过程中，易丢失部分蛋白质，难获取全蛋白【4 用破碎技术有丙酮沉淀法、裂解法、冻溶法和酶解法等【l“J。针对生物材料来源不同，优化提取组织细 胞全蛋白和减少内外干扰物是开展蛋白质组学必须克服的难题。至今，相关的研究已有大量且详细的 研究报道【5．6J，但尚未建立一套较为成熟、重复性高和广谱性好的细胞组织全蛋白质提取方法。环境蛋 白质组学是目前环境毒理学中最有挑战性和前瞻性的领域之一，相关的研究仅仅处于起步阶段。环境 蛋白质组学能同时筛选与鉴定出由各类重金属和有机污染物，在单一和联合胁迫效应环境中所诱导的 多种蛋白指示物¨’8J，为揭示复杂的毒理机理和评价危害性提供实验证据¨，2，9j。 本实验以牙鲆肝脏组织为材料，选用差速离心和双向凝胶电泳非在线联用技术，高效提取和优化分 离受镉盐胁迫前后的牙鲆肝脏全蛋白，为后续选用蛋白质组学技术筛选及鉴定监测镉污染程度及危害 性的蛋白质标志物提供可信度较高的结果。 2实验部分 2．1仪器、试剂与材料 机(贝克曼公司)-b载体两性电解质(Amersham公司)，pH mmol／L 上海生物工程技术有限公司；匀浆缓冲液：0．25mol／L蔗糖，1 EDTA，50rnmol／LIris—HCl， 1 mmol／L mmoL／L mol／L尿素，4％CHAPS，2mol／L硫脲，60 DIT， PMSF(pH=7．4)；样品裂解液：7 2008．12—14收稿；2009-03—13接受 本文系国家自然科学基金资助项目(No和福建省高校创新研究团队基金资助 $E·mail：hqhuang@xlnu．edu．cn 万方数据万方数据 1020