抗秦川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定.pdf

摘 要 【目的】本研究拟采用秦川黄牛重组成熟朊蛋白(PrP)的纯化复性产物作为免疫原，应用 淋巴细胞杂交瘤技术制备出抗牛成熟朊蛋白的单抗(mAb)，为研制疯牛病免疫诊断试剂 盒奠定基础。 r方法】将本实验室保存的含有秦川黄牛成熟PrP基因的重组质粒pET30a．PrPf25~242aa) 转入大肠杆菌叵co』j 采用Ni．NTA亲和层析法纯化融合蛋白，透析法复性纯化的重组表达产物，考马斯亮蓝染 色法测定蛋白浓度。以sAF70进口单抗为检测抗体，westemblot分析融合蛋白的免疫反 应性和对蛋白酶K的敏感性。以纯化复性的牛成熟PrP融合蛋白作为免疫原，以含有 JMl09(DE3)的菌体蛋白作为对照免疫原，分别与弗氏完全 pET30a(+)空载体的￡cD』j 第4周和第8周皮下注射同等剂量的以弗氏不完全佐剂乳化的免疫原，在第12周按150LL2／ 只剂量直接腹腔注射PBs稀释的免疫原。3d后取PrP融合蛋白免疫小鼠脾细胞与sP2／0 性对照，SP2／0细胞上清液l：1和对照免疫鼠血清1：960作阴性对照，加入辣根过氧化酶标 照3倍以上者初步判定为阳性克隆。将阳性克隆N64杂交瘤作有限稀释，3次亚克隆后液 氮冻存细胞并连续传代3个月检测杂交瘤分泌抗体的稳定性。将N64杂交瘤细胞按1×106 A 腹腔注射经无菌液体石蜡预处理的BALB／c小鼠制备腹水单抗。以PfoteinAgafose亲和 层析法纯化腹水抗体，双抗体夹心法检测N64单抗的Ig类和亚类，间接ELIsA法测定纯 化的腹水抗体的效价和相对亲和力，Wjstemblot分析N“单抗的特异性，采用基因片段 表达作图法初步分析抗原表位。 【结果】获得了能稳定分泌抗牛成熟朊蛋白的杂交瘤细胞株N64，分泌的抗体属于IgG2a， blot表明N64单抗具有较强的特异 腹水效价为1×105，相对亲和力为0．2pg／mL。westem 性，表位分析显示N64单抗仅与羧基端重组朊蛋白反应。 【关键词】牛海绵样脑病 成熟朊蛋白 单克隆抗体 间接ELISA Summary obtainmonoclo曲1 ma加re 0bjectiVe：To antibody(mAb)againstprion ye¨ow cattIe，the a11drefoldedrecombin觚tboVinemature were as pur．6ed priOn proteinsregardedimmunogen，so thatitwillestablishbaseforBSEimmune kit． diagnosisreagent recombjna|1t caltle Method：Trallsformingplasmids(pET30a-PrP(25～242aa)conlainedQjnchuallye¨ow inthelab P硭ⅣPandconserved intoE．∞，f wereobtained JMl09(DE3)，theexpressedproducts from reombinantbacteriuminducedIPTb锄dwcreidentifled SDS—PAGE by co肥ctlyby analysis．Sincethen，the fusion were Ni．N1’A