检测人可溶性HVEM双抗体夹心ELISA法建立及部分自身免疫病患者可溶性HVEM检测.pdfVIP

检测人可溶性HVEM双抗体夹心ELISA法的建立及部分自身免 疫病患者可溶性HVEM的检测 中文摘要 【目的】 entry 共刺激分子HVEM(herpesvirus 的TNF受体超家族的成员，表达在多种免疫细胞表面，包括T细胞、B细胞、自 然杀伤细胞州K)及树突状细胞(DC)，扮演一个双相调节T细胞活性的角色，通过 与配体LIGHT结合提供给T细胞一个正性刺激信号，通过与免疫球蛋白超家族的 成员BTLA结合供给T细胞一个抑制性信号，因此有人将HVEM称作“双向开关” (bidirectionaI Switch)蛋白。研究发现，HvEM分了在肿瘤、自身免疫病及器官 移植排斥反应等疾病中扮演重要角色。已证实自身免疫病患者CD4+T细胞异常高 CD4+T细胞辅助下，B细胞产牛大量不同种类的自身抗体，造成组织器官损伤。 重组hHVEM蛋白作为抗原制备兔抗人HVEM多克隆抗体，并建立检测人可溶性 HVEM(soluble sHVEM水平进行检测，以探讨sHVEM的检测对自身免疫病的辅助诊断及病情观察 的意义，并为研究HVEM在自身免疫病发牛、发展中的作用奠定基础。 【方法】 1．pET．32a／hHVEM原核表达载体的构建 采用分子克隆技术，将人HVEM基因序列克隆插入pET．32a载体，将重组质 粒转化至E∞，fDH5a，并对重组质粒进行鉴定。 2．His-hHVEM蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 将pET．32a／hHVEM重组质粒转化至EcD疗BL2l(DE3)，经lPTG诱导，表达 大量可溶性His-hHvEM蛋白，采用SDS．PAGE电泳鉴定。 3．兔抗人HVEM多克隆抗体的制备及鉴定 用纯化的重组人HVEM蛋白作为抗原，免疫家兔，制备兔抗人HVEM多克隆 抗体，并对其特异性及纯度进行鉴定。 4．hHVEM ELlSA检测方法的建立 以抗人HVEM单克隆抗体作为包被抗体，纯化的重组人HVEM蛋白作为参考 标准品，兔抗人HVEM多克隆抗体作为捕获抗体，HRP标记羊抗兔IgG作为二 抗，建立检测可溶性HVEM的ELISA夹心法。 5．自身免疫病患者血清sHVEM的检测 用建立的检测sHVEM法对12例类风湿关节炎(rheumatoidanhritis，RA)、33 例强直性脊柱炎(ankylosing lupus 作为对照，分析自身免疫病患者与正常体检者血清sHVEM浓度的差异。同时采用 ELISA法对12例RA和36例SLE患者血清及正常体检者血清IL．17水平进行检 测，并对患者组血清sHVEM、lL．17水平进行相关性分析。 【结果】 1． pET．32“hHVEM原核表达载体的构建 经PCR及测序鉴定，成功构建了原核表达载体pET．32a／hHVEM。 2．His-hHVEM蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 pET．32帅HVEM重组质粒转化至E∞疗BL2l(DE3)，经lPTG诱导后，DE3 PAGE电泳鉴定，获得较高纯度的His．hHVEM蛋白。 3．兔抗人His．HVEM多克隆抗体的制备及鉴定 成功制备了兔抗人HVEM多克隆抗体，经过硫酸铵盐析初步纯化后，其 身免疫病患者血清中HVEM，其纯度及特异度均达到后续试验要求。 4．可溶性hHVEMELISA检测方法的建立 成功建立了可溶性hHVEM ELISA检测方法，检测范围在7．81pg，L～250¨∥L 之间，批内和批间变异系数分别为8．03％和13．7％，平均回收率达到了86．3％，说 明该方法的准确度和精密度都较好。 5．自身免疫病患者血清sHVEM的检测 进行检测，结果显示，SLE、RA及AS患者血清sHVEM水平均高于正常对照 平呈正相关。 【结论】 成功构建了pET．32矶HVEM原核表达载体，成功表达、获得较高纯度的 E His-hHVEM蛋白；成功制备兔抗人HVEM多克隆抗体，建立了sHVEMLISA检 测方法；初步证实了sHVEM在SLE、RA及AS患者血清中含量增高，提示 sH