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低温对人脐血内皮祖细胞的影响 中文摘要 研究背景和目的 内皮祖细胞(endothelial progenitor 仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程， 并在内皮功能障碍相关性疾病的发生、发展中扮演重要角色，尤其是冠心病 heart (coronary pulmonary 是一种具有应用前景的治疗方法。Assmus等直接将体外扩增后自体内皮祖细胞应 用于临床治疗急性心肌梗死，证实EPC移植治疗是安全可行的。陈君柱等将体外 扩增后自体EPC应用于临床治疗特发性肺动脉高压患者，2006年随机对照试验结 束，结果显示EPC移植治疗特发性肺动脉高压是安全、可行和有效的。 临床上开展EPC移植治疗需要大量细胞，来源难以保障，然而建立EPC库可 以解决细胞来源的问题。成体EPC具有免疫原性，同种异体间移植会导致免疫排 斥，临床应用有局限性。脐静脉来源的EPC几乎无抗原性，不易免疫排斥，且细 胞含量丰富、体外增殖能力强，适宜于建库。 本实验的目的：从人脐血中分离培养出内皮祖细胞，将其进行低温保存和快 速复苏，建立EPC细胞系比较冻存前后细胞形态及生物学功能是否改变，胎儿脐 带血EPC系的建立将为研究人类EPC的生物学功能及分化发育、内皮功能障碍性 疾病的治疗等提供了丰富的种子细胞。为其建立人脐带血EPC库，并最终将其初 步应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病和特发性肺动脉高压的治疗。 实验方法 足月分娩的无传染性疾病健康妇女38例。待新生儿娩出后，在距脐轮约5～ lOcm处用止血钳夹住脐带的两端，于两钳之间剪断脐带，在产妇侧脐带的一 l 河南大学2010届硕士掌位论文 端选择显露而粗大的脐静脉，穿刺成功后利用子宫阵发性收缩和注射器的负压 让脐血顺利流入50ml的注射器内，采血完毕，及时钳住穿刺处。 2．单个核细胞的分离和培养：在超净工作间内，利用密度梯度离心法将单个核细 胞从脐血内分离出来，将细胞悬液接种于预先包被有人纤维连接蛋白(FN)的 培养箱中，每5天对细胞换液继续培养。采用acLDL-Di 正在分化的EPC。 3．细胞的冻存和复苏：将每例脐血经密度梯度分离及体外培养传代后所得到的内 皮祖细胞平均分为两份，一份低温程序冻存作为实验组；一份未冻存继续体外 培养作为对照组。利用配制好的冻存液稀释经离心收集的内皮祖细胞，调整细 将冻存盒内的冻存管取出，迅速放入37℃水浴中并不停的摇动使其在lmin内 快速融化，加入上述培养液洗涤两次，去除冻存保护液的毒性作用，收集细胞 计数细胞总数和计算细胞成活率，以待进一步实验。 4．内皮祖细胞增殖能力的测定：2．5％的胰蛋白酶和0．2％的EDTA消化贴壁细胞， 养箱中培育4h。取出96孔板，每孔加入DMSO nIIl处检测细胞OD值。 标仪波长490 5．内皮祖细胞粘附能力的测定：上述方法消化贴壁细胞，调整细胞浓度，加入预 先包被FN的6孔培养板中，置入培养箱中1h，显微镜下读数。 结果 1．人脐静脉血经1：1稀释后缓慢加入人淋巴细胞分离液，离心后可见清晰的分 层：最上层为血浆和血小板，中间白膜层为单个核细胞层，下层为分离液层， TI 低温对人脐血内皮祖细胞的影响 最下层为红细胞层； 2．细胞形态学观察：密度梯度离心法所得的单个核细胞接种于培养板中，细胞 呈圆形，大小均匀的分布在板底，5天后换液去除悬浮细胞，可见略呈圆形的 贴壁细胞，细胞数量较少但有大量细胞集落形成；继续培养至第15天可见细 胞数量较多，呈圆形椭圆形或者梭形，但细胞集落形成减少； 的EPC； 4．细胞的冻存和复苏：经培养换液所得的EPC经上述程序冻存和复苏后可测得 细胞的存活率为(84．17±4．02)％，细胞的形态学未见明显改变； 5．细胞增殖和粘附能力的变化：与未冻存的细胞相比，刚刚复苏后即行增殖和