0Y_果蝇与其他物种遗传标记比较分析-RAPD 091029.pptVIP

RFLP AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. AFLP technology combines the power of Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) with the flexibility and power of PCR. 荧光标记全自动AFLP原理与方法 * * 实验 0Y 果蝇遗传标记分析-PAPD 一、实验目的： 1. 掌握RAPD分析基本方法技术; 2. 了解分子标记的重要应用价值 . 二、主要内容： 基因DNA提取 PCR反应 电泳 电泳图谱的观察、分析 助教： 王家文 （1）D.Virilis ------------10只 （2）黑腹果蝇—P、F1、F2 （3）其他材料 -- 0.2g 1份（3种果蝇样品+2种其他）/小组 果蝇用自己存的材料。 材料： ?1. 提取粗DNA液 现在先做（合理分工、协调时间）： 每份材料（普通果蝇20只、大果蝇10只、或其他材料0.2g） +50μL匀浆缓 冲液匀浆 液体倒入1.5ml离心管 +等V苯酚-氯仿（1:1）颠倒混匀30s,12000rpm， 5分钟。 助教把握时间！！ + 50 μL 10%SDS 颠倒混匀20s，65 度水浴30min 加入200μL的匀浆液 10000rpm，3min，转移上清。 移上清于另一离心管，+等V苯酚-氯仿（1:1）颠倒混匀，13000rpm， 5分钟。 12000rpm，10min 移上清于另一离心管，加入2倍体积的无水乙醇，静置10min。 弃上清，70%乙醇洗涤沉淀， 10000rpm，3min 弃上清，超净台吹干沉淀。加入20ul的无菌水，溶解沉淀，备用。 注意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，枪头从液面上层往下层缓慢的移动，不要带入其它杂质。 （1） 组织匀浆液（已经准备好） ： LiCl 0.40 mol·L-1 Tris·HCl 0.20 mol·L-1（pH9.0） EDTA 2.5 mmol·L-1 RNaseA 100 g·L-1 （2） SDS 10% wt/vol （已经准备好） 相关试剂 (3) 25 x TAE(在15’离心时配制) 500ml 用于后边的电泳 Tris 12.1 g 冰醋酸 2.86 mL Na2EDTA?2H2O 1.86 g ddH2O 定容到100 mL (一人配置，全班公用，用时稀释) 三、实验原理 : RAPD:建立在PCR基础上的一种分子标记。 模板高温变性→足够低的温度下（通常为36℃）与随机引物（一般10个bp）退火→ PCR →电泳 如果两个退火位点足够近（200-2000bp左右）、分别位于互补的DNA链上，可以通过PCR扩增出DNA片段。 引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。 若位点2处碱基发生改变，则 3. RAPD反应 1‘．在0.2ml PCR管中配制20μl反应体系 随机引物 1μL ddH2O 6μL 每组领取5份样品所需量 各组等分5份 分别加5种样品的模板DNA 各 3μL 包括 dNTP Mixture, Taq酶, 10×PCR buffer PCR mixture 10 μL 2’．在PCR热循环仪中进行如下反应： 94℃ 200s→ 94℃ 60s→36℃ 60s→72℃ 120s 40个循环 →72℃ (300s--600s) 4．电泳（后继课中*） 1.5%琼脂糖凝胶（用20mL的1×TAE溶解琼脂糖配制）电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。 *第12周“非中断杂交实验”的“扩菌、倒所有的平板”步骤后（可以由一个同学提前一会儿进行） 操作分工 技术问题 注意事项 实验课老师助教指导： 实验报告（为果蝇系列实验的最后部分）： 1. 简单体现RAPD的实验原理、