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第三章 光谱分析技术 第一节 吸收光谱分析 第二节 散射光谱分析 第三节 发射光谱分析 本章小结 * * 掌握吸收光谱分析原理,比色的标准曲线法、标准对比法、摩尔吸光系数法,分光光度计的结构及波长检测,比色皿的配套检测。 熟悉722型分光光度计的使用,散射光谱法,发射光谱法。 了解原子吸收分光光度法。 光谱技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法,因不同分子的原子团和原子,其发射光谱和吸收光谱不同,而相同的物质在一定条件下,其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。因此可对物质进行定性和定量分析,此类技术称为光谱技术。 光谱分析技术是一种最常用的生化检验技术,它主要包括: 吸收光谱分析:可见、紫外、红外分光光度法和原子吸收分光光度法 散射光谱分析:比浊法 发射光谱分析:火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 光是一种高速传播的电磁波,光的波长(λ)的常用单位是纳米(nm),可见光波长400~760nm,<400nm称为紫外光,>760nm称为红外光,波长愈短,能量愈大。 可见、紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下,由基态跃迁到激发态,这种因物质分子对辐射能的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。 第一节 吸收光谱分析 吸收光谱分析法包括可见、紫外、红外和原子吸收分析法。其中最常用的是可见光分析法,也被不严格地称为比色分析法,准确的名称应是可见光分光光度法。 用于比色分析的光源与被测溶液的颜色应为互补色。 可见、紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光吸收定律,即Lambert-Beer定律,它是吸收光谱法的基本定律。 一、Lambert-Beer定律 1. Lambert定律 当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后,由于溶液吸收了一部分光,则透过的光线为It。当溶液浓度不变时,透过的液层愈厚,则光线强度的减弱愈显著。 It I0 用数学式表示为: 透光度随溶液厚度增加而减少,其关系是透光度的负对数(-lgT,吸光度A)与溶液厚度成正比,即 2. Beer定律 当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后,若液层厚度不变,而浓度不同时,溶液的浓度愈大,则透过光的强度愈弱,其定量关系A=K·C。 当液层厚度不变时,吸光度与溶液浓度成正比,这就是Beer定律。 3. Lambert-Beer定律 合并Lambert定律与Beer定律可得 A=K·L·C 说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的浓度和液层厚度成正比。 吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度,在给定条件下(波长、溶液性质、浓度)吸光系数是物质的特征常数,K值愈大,能测定的浓度C愈小,则灵敏度愈高。 二、比色分析仪器 即可见光分光光度计,各类分光光度计的结构和原理基本相同,一般包括光源、单色器、吸收池、检测器和显色器五大部分。 1. 光源 可见光常用钨灯,现用卤钨灯;紫外光常用氢灯。 2. 单色器 可用滤光片、棱镜、光栅。 3. 吸收池 (比色杯) 4. 检测器 光电管或光电倍增管 5. 显示器 指针式或数字式 三、比色分析的特点 1. 灵敏度高 被测定物质的最低浓度一般为10-5~10-6mol/L。 2. 测定快速、简便。 3. 应用范围广 一些无色物质在一定条件下与显色剂反应,可生成有色物质。 四、比色分析的定量方法 (一)对比法 又称标准对比法,通常在测定未知浓度样品的同时,测定一已知浓度的标准液作比较,然后分别测定两者的吸光度。 AS=K·LS·CS AU=K·LU·CU 因测定成分相同,故K值相同,比色时用同样规格的比色皿,故LS=LU,所以比色分析中标准液与样品液的吸光度比值就等于其浓度比,即 CU = ×CS 若标准液与样品用量不等时,则再乘 。 用对比法进行
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