采用质粒DNA研究人结缔组织生长因子（hCTGF）对骨损伤修复作用.pdfVIP

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2007，27(11)：16～19 采用质粒 DNA研究人结缔组织生长因子 (hCTGF) 对骨损伤修复作用冰 孙 明 和占龙 王晶晶 鲁帅尧 王丽春 赵 远 李琦涵 (中国医学科学院／中国协和医科大学医学生物学研究所 昆明 650118) 摘要 目的：研究人结缔组织生长因子(hCTGF)对细胞的增殖作用及其骨损伤促愈合的生物学 作用。方法：利用真核基因导入系统，转染具有分化潜能的成纤维细胞，并导入骨折实验动物模 型，利用分子生物学和临床骨科技术检测分析，获得数据。结果：明确 了hCTGF对细胞的增殖作 用，表明了hCTGF以基因治疗为手段具有修复骨损伤的生物学活性，为该因子在临床上治疗骨损 伤提供新的活性因子和新的治疗方法。 关键词 hCTGF 基因表达系统 骨创伤 愈合 中图分类号 Q819 骨折愈合是一种特殊的创伤愈合反应，能通过骨 体内及体外的相关生物学试验，并建立了相应的生物 骼再生恢复骨的完整性。在临床治疗中，有5％ ～10％ 学活性检测体系，进行了对骨损伤促进愈合的试验 ，完 的骨折发生延迟愈合或不愈合。实验表明外源性的成 成了该系统以基因治疗的手段进行修复骨损伤的相关 骨蛋白在一定程度上可以促进骨折愈合，但是由于此 研究。 类蛋白半衰期较短、生物活性偏低、价格昂贵、需要反 1 材料与方法 复施用、没有理想的介质等，严重影响了外源性因子的 治疗效果… 。 1．1 材 料 人结缔组织生长因子(hCTGF)是一类属于CCN家 1．1．1 细胞和质粒 人二倍体细胞 KMB一17株：医学 族的富含半胱氨酸(Cys)的生长因子，它具有多种生物学 生物学研究所保存；hCTGF基因：医学生物学研究所保 活性，包括促进细胞增殖、迁徙、粘附、胞外基质形成以及 存。表达载体pcDNA3，本实验室保存。 血管生成活性等功能。CTGF可在多种细胞如成纤维细 1．1．2 工具酶及化学试剂等 限制性内切酶和连接 胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、上皮细胞、软骨细胞、成 酶等购 自TaKaRa公司；丙烯酰胺、N，N一亚甲基双丙烯 胶质细胞瘤细胞中表达。当受创伤刺激或某些细胞因子 酰胺 、TEMED、B一巯基 乙醇：Pharmacia公 司，Sigma公 作用从而促进细胞的增殖和粘附、增强炎性细胞的趋化 司；酵母浸膏、蛋白胨、细菌培养用琼脂粉：Difco公司产 性 【。因此，CTGF可以参与多种生理学过程，如血管生 品；DMEM培养液：GIBCO公司。 成、胚胎发育和分化、骨骼形成／再生、创伤愈合、肢体再 1．1．3 试剂盒 小量质粒快速抽提纯化试剂盒，小量 生、器官移植等。由于 CTGF的这些生理学特性及生物 PCR产物纯化试剂盒：上海华舜生物工程公司；荧光蛋 学功能，使得 CTGF在各类创伤修复，包括外伤修复、软 白检测试剂盒：Simga公司；快速连接试剂盒：TaKaRa 骨形成、角膜再生修复等方面较好的应用潜力_3J。 公司。 我们构建了人结缔组织生长因子的真核基因表达 1．1．4 实验用动物 日本大 白兔 由昆明医学院动物 系统 (pCDNA3-hCTGF)。将结缔组织生长基因进行了 中心提供，动物质量合格证号为0001387，动物级别为 I 级 ，实验前一周领取，雌雄各半，体重2．0～2．5kg，年龄 收稿 日期：2007-06-25 修回日期 ：2007-09-03 云南省 自然科学基金资助项 目(2002C0026Q) 100～12