茶树β-1，3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的优化表达.pdfVIP

维普资讯 安徽农业大学学报，2007，34(4)：543-546 JournalofAnhuiAgriculturalUniversity 茶树 13-1，3葡聚糖酶基因在大肠杆菌 中的优化表达 高 轩 ，江昌俊 ，朱 林 ，余 梅 ，叶爱华 ，邓威威 (1．安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，合肥 230036；2．安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036) 摘 要：从茶树中获得 31-1，3葡聚糖酶(31-1，3-glucanase，31-1，3-glu)基因cDNA，发现其中存在着一些序列， 它们与核糖体竞争性地结合pET32a载体上的RBS位点，造成该基因cDNA在原核生物中很难表达。作者对其中 的两处基因序列进行了突变，通过设计PCR引物，利用密码子的简并性 ，保证了突变后蛋白质的一级结构不变。使 葡聚糖酶基因在大肠杆菌中明显表达。通过SDS—PAGE分析，证明表达产物分子量约75．8kD，与预计大小一致 ， 并通过水杨酸法对其进行酶活测定，证 明其有活性。 关键词：茶树；B—l，3葡聚糖酶；原核表达 中图分类号：$571．1；Q786 文献标识码 ：A 文章编号：1672—352X(2007)04-0543-04 Optimizingthetranslationoftea 1，3-glucanasegeneinE．coli GAOXuan一，JIANGChang．inn，ZHULin，YUMei，YEAi—hua，DENGWei—wei (1．KeyLaboratoryofTeaBiochemistry andBiotechnology，Ministry ofAgriculture，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036； 2．S~hoolofLifeScience，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036) Abstract：Thegeneof13-1，3一glucanase(31-1，3-glu)extractedfromteaisfoundtobedifficultlytranslatedin prokaryoticcell，forsomesequencesbindingwiththeRBS (ribosomebindingsite)competewiththeribosome． However，itgetsmucheasiertobetranslatedinE．colibymutatingthesetwosequences．Tomakesurethatthepri- marystructureofproteinarenotaltered，experimenttechniquessuchasPCR intheteam ofsynonymouscodonsare conducted．Molecularmassofthetranslatedproteinprovedtobe75．8kD bySDSasexpected．Inaddition， itsenzymeactivitywasdetectedbySalicylicacidmethod． Keywords：teaplant(Camelliasinensis)；31-1，3-glucanase；expressinE．coli 真菌病害一直是造成茶树产量损失的主要原因 原核基因在真核生物中表达的目的 。 之一。随着植物分子生物学的迅速发展，抗病基因 在茶叶31-1，3葡聚糖酶 (31-1，3-glucanase，31—1， 工程应运而生，为人们提供了一种既不污染环境，又 3．glu)基因中，有 3处序列与载体pET32a中核糖体 稳定有效的防病途径 ¨。 结合位点 (ribosomebindingsite，RBS)互补，造成外 真核基因在原核中往往会 由于各种原因而无法 源基因的表达困难，通过将其中两处进