大菱鲆两种转基因方法的比较研究.pdfVIP

维普资讯 大菱鲆两种转基因方法的比较研究 刘 婷 2，刘庆华 2，谭训刚17张培军 ，徐永立 (1．中国科学院 海洋研究所，山东 青岛266071；2．中国科学院 研究生院，北京 100039) 摘要：对外源基因导入大菱鲆 (Scophthatmusmaximus)的两种方法进行了研究，采用经过 改进的电脉冲方法以及哺乳动物细胞中常用的转染法导入外源基因，并对两种方法进行比 较。电脉冲最佳导入条件为：脉冲电压为300Vc／m，脉冲次数为5，外源DNA质量浓度为 20mg，L；转染法的最佳操作时间为受精后50min 应用上述两种方法进行批量转基因鱼实 验，得到外源基因的导入率分别为20％～28％和60％～70％。实验表明利用转染试剂 ietPEI 处理单细胞期的大菱鲆受精卵能得到较高的孵化率及较高的转基因效率。 关键词：转基因效率；电脉冲精子介导法；转染；大菱鲆 (Scophthatmusmaximus) 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1000—3096(2007)11-0009—05 自20世纪80年代首批经显微注射的转基因鱼问 水产有限公司提供。质粒载体 mylc—MSTNp 由美国 世以来 l【1，世界范围内很多实验室都进行了一系列的 马里兰大学海洋生物技术中心杜少军教授馈赠； 转基因鱼的研究[]。目前，各国不同实验室尝试过 dNTP，Taq酶购 自Promega公司；转染试剂 jetPEI 的转基因方法有显微注射法、电脉冲基因转移法、精 购自Qbiogene公司。电脉冲仪由本实验室自主研制， 子介导法、磷酸钙共沉淀法、反转录病毒介导法、脂 总电压 100~400V，脉冲次数为 1～7，脉冲宽度为 质体介导法、激光穿孔法等[7-10]。上述方法各有优点， 25ms。 但普遍存在着操作不方便、受精卵损伤较大等问题。 1．2方法 因此需要探索新的、操作简单、对受精卵破坏性较小 1．21 精子和卵子的获得 的转基因方法以提高转基因效率。在本实验中，作者 采用人工挤压方法将精子挤出并收集到干净烧 首次使用了转染试剂 ietPEI(Qbiogene)转染外源基 杯中，加入 25倍体积的精子稀释液 (NaC10．65g， 因到大菱鲆的受精卵中。以往转染法主要应用在哺乳 KC10．041g，无水CaCI20．012g，Na2H]aO40．002g， 动物组织细胞的转基因实验中l【”，而动物受精卵中的 葡萄糖0．2g，NaHCO0．02g，溶于 100mL蒸馏水中， 应用尚处于探索阶段 ¨2_。将转染法应用到海水鱼卵的 用一次性细胞滤器过滤)，置于冰上。卵子也采用人 转基因实验，尚属首次。 工挤压的方法，用 100fnL的无菌烧杯收集。 作者应用经过改进的电脉冲精子介导法和转染 1．2．2 电脉冲转基因实验 法进行转基因实验，并对二者进行了比较。结果表明， 利用转染试剂 letPEI转染鱼受精卵的方法条件温和， 收稿 日期：2006．02．26；修回 日期：2007．04．18 物理损伤小，具有较高的孵化率和外源基因表达率， 基金项 目：国家863计划 资助项 目(2004AA6281lO)： 国家 是一种有效的转基因方法。 973计划(2004CB117402)；青岛市科技局资助项 目 作者简介：刘婷(1981-)，女，山东济宁人 ，硕士研究生，主要 l材料和方法 从事动物发育生物学及分子生物学研究，电话：0532 1．1材料 E—mail：nancyflower81@hotmail．com；张培军，通讯作者，Em·ail： 大菱鲆 (Scophthatmusmaximus)由莱州市大华 pjzhang@ms．qdio．ac．cn MarineSciences／Vo1．31，No．11~007