泡球蚴组织体外培养在药物筛选及汉防己甲素作用机制研究中应用.pdfVIP

泡球蚴组织体外培养在药物筛选及汉防己甲素 作用机制研究中的应用 摘要 意义：泡型包虫病(alveolarechinococcosis)又称泡型棘球蚴病或泡球蚴病， 是由多房棘球绦虫的幼虫引起的一种严重危害牧区人民健康和畜牧业发展的寄 生虫病。虽然目前已成功建立了泡球蚴感染的动物模型，但宿主与寄生虫之间的 关系非常复杂，动物模型往往不适用于对寄生虫成分和生理功能的研究。因此， 日趋成熟的泡球蚴组织体外培养技术受到越来越多学者的青睐。本实验通过泡球 蚴组织体外培养模型，对汉防己甲素、己酮可可碱、氧氟沙星和苦豆碱的疗效进 行了初步的筛选，并应用磷酸盐一焦锑酸盐细胞化学法 作用机制。 目的：建立泡球蚴组织体外培养模型，对汉防己甲素、己酮可可碱、氧氟沙 星和苦豆碱体外抗泡球蚴病的疗效进行初步筛选，应用磷酸盐一焦锑酸盐细胞化 学法探讨汉防己甲素治疗泡球蚴病的机制。 方法：无菌条件下取出泡球蚴组织剪成小块，用无菌的PBS冲洗后，每个 培养瓶(已用肝癌细胞株包被)中放入4块，加入DMEM完全培养基，隔天换液。 培养8周后，分为7组：空白组(未用药组)、对照组(等量二甲基亚砜)、阿苯达 唑组、汉防己甲素组、己酮可可碱组、氧氟沙星组和苦豆碱组。分别于加药24h 和18d时，随机抽取各组囊泡固定，进行超微结构观察，汉防己甲素组囊泡按照 PPA法固定。实验期间每天换液并记录囊泡的塌陷情况。体外实验结束后，将培 养物接种Balb／c小鼠进行活力测试。 结果：体外培养6周后，囊泡的体积和数量都明显增加。8周后，每个培养 瓶中的游离囊泡数稳定在60一100个，直径基本在1—6mm之间。收集囊泡并随 机分为7组，每组约70个囊泡，即：空白组(未用药组)、对照组(等体积二甲基 加药24h后开始塌陷，汉防己甲素组和己酮可可碱组的囊泡在加药48h后出现塌 陷；用药l8天后，阿苯达哗组囊泡全部塌陷，而汉防己甲豢组和己酬可司碱组 尚有少量囊泡未塌陷。氧氟沙星组利：苦豆碱组的囊泡在用药前后无明显变化。超 微结构：加药24h后，阿苯达唑组、汉防己甲素组和己酮可可碱组的囊泡表现为 微毛减少变短，同时线粒体有不同程度的肿胀。治疗18d后，阿苯达唑组、汉防 己甲素组和己酮可可碱组囊泡表现为微毛消失，部分区域的角皮层和生发层分 离，生发层的结构完全破坏，只能看到一些细胞碎片：氧氟沙星组和苦豆碱组囊 泡的超微结构与空白组无明显差异。PPA法显示，加入汉防己甲素24h即可在泡 球蚴的线粒体和内质网膜上见到大小形状不一的黑色的钙盐沉积，同时线粒体有 不同程度的肿胀。汉防己甲素治疗18d后，泡球蚴的线粒体膜上可见有大量高电 子致密物沉积，线粒体肿胀明显并发生破裂。将各实验组的培养物接种Balb／c 小鼠，饲养80天后处死并解剖观察，每组小鼠的腹腔内都发现了泡球蚴组织的 生长且各组囊湿重无统计学意义(PO．05)。 结论：通过SPSSl0．0统计分析软件求出各组的回归方程并运用t检验两两 比较各组的回归系数得出f检验水准：n=0．005)：汉防己甲素和己酮可可碱在体 外能够抑制泡球蚴的生长偿O．005)，氧氟沙星对寄生虫没有作用(P0．005)，苦豆 碱还表现出相反作用(P0．005)。通过运用磷酸盐一焦锑酸盐细胞化学法(PPA)i正 明，对钙通道的阻滞并启动细胞凋亡是汉防己甲素体外治疗泡球蚴的机理之一。 Balb／c小鼠饲养80天后处死并解剖，发现所有小鼠的腹腔中均有泡球蚴生长且 各组囊湿重无统计学意义(PO．05)。这说明泡球蚴组织体外培养是成功的，同时也 提示，汉防己甲素和己酮可可碱在体外也仅有抑制作用而不能完全杀灭寄生虫。 关键词：泡球蚴，多房棘球绦虫，体外培养，阿苯达唑，汉防己甲素，己酮 可可碱，氧氟沙星，苦豆碱，磷酸盐一焦锑酸盐细胞化学法 Invitroculture multilocularismetacestodestoscreen ofEcinococcus the of and onthemechanismoftetrandrine efficiencydrugsstudy Abstract larval ofEchinococcus alveolar Signi