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单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1 陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪 广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021 ） E-mail ：lcling78@163.com 摘 要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。方法：以原代培养的 成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为 0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L ），与神经细胞共孵育。显微镜观察各组神经细胞形态学的 变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE ）检测神经细胞的DNA 损伤，以彗星细胞尾长及彗 星样细胞百分率为评价损伤的指标。结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发 生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA 出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样 细胞百分率较对照组明显增加（P ＜0.01 ）。尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度 组（P ＜0.01 ）。结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经 细胞DNA 的损伤。 关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE) ，DNA 损伤 目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长 期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。慢性锰中毒是进行性的、 不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的 效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问 题。 DNA 损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的 DNA 损伤累积可诱导 细胞突变、畸变。单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay ），由Ostling 等（1984）首创，后经Singh 等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一 种快速检测单细胞 DNA 损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线 等对DNA 的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经 济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。鉴于此，本研究 以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提 供研究基础。 1. 材料与方法 1.1 试剂 MnCl ·4H O(购自上海生化试剂公司, AR 级), Dulbccos Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及 2 2 新生小牛血清购自Gibco 公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PLYS)购自生物工程产品公 司（上海）.低熔点凝胶(LMPA) 及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分 析纯级 1.2 皮层神经元的原代培养 [1] 制备原代皮层神经元方法参照方法所述 . 取新生24 小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰 层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s 液的玻璃 瓶，机械法分离神经细胞。200um 稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液 800 转/分离心 5 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号）的资助。 -1- 分钟，弃上清，重悬细胞并离心，重复3 次 。最后，以含15%新生小牛血清的DMEM 调 5 整细胞密度为1×10 /ml ，接种于24 孔板内的圆玻片上，玻片提前用多聚赖氨酸包被（隔夜）， 细胞培养于37°C、5% CO2 培养箱。3-5 天后加入阿糖胞苷(Ara C, 10-5mol/l) 以抑制非神经细 胞增殖。 1.3 尼氏染色 确认培养物即是所需神经细胞，采用传统的的尼氏染色法，步骤如下。镊子夹出孔板中 的圆玻片，PBS 小心洗