蛋白质组学的研究进展.ppt

一、蛋白质组学的产生背景及概念 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。 随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。 蛋白质几乎参与了所有的生命活动，只有蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。 蛋白质组与蛋白质组学 （1）蛋白质组（Proteome ）：蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。 （2）蛋白质组学（Proteomics ）：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 二、蛋白质组学研究的内容 1. 蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学） ： 2-D电泳、色谱技术 2. 蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）： X-射线衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构技术（电子晶体学）。 3. 蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）： 确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。 4. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）： 蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用 三、蛋白质组学研究的手段 （一）蛋白质表达模式研究技术：2-D电泳 1.1975年，Patrick OˊFarrel发明了二维凝胶电泳。 2. 操作 （1）等电聚焦电泳 （2）第二向SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 双向电泳凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异 垂直方向反映出它们在分子量上的差别 差异蛋白质点鉴定 蛋白质表达模式研究流程 三、蛋白质组学研究的手段 （二）构象解析技术 实际测定具体蛋白质的三维结构： X-射线衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构技术（电子晶体学）。 X-射线衍射分析：最成熟和最有力的方法。 2. 通过氨基酸序列去辨识和预测出其决定的三维结构 （1）用分子力学、分子动力学的方法，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 （2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。 三、蛋白质组学研究的手段 （三）蛋白质序列测定 1. 英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。 4. 20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂——DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。 5. 对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。 7. 蛋白质C端测序： C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。 （1）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。 （2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定。 8. 质谱法用于蛋白质顺序测定： （1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。 （2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。 （3）20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。 电喷雾质谱测定分子量的准确度可达万分之一，主要优点是可与HPLC仪实现液质联用，因而能使一个蛋白质的酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。 飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分析，误差率可精确到十万分之一，该方法一个显著的