木聚糖酶的酶活测定.docVIP

木聚糖酶的酶活测定方法 原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的木聚糖酶的活力成正比。 酶活定义方法 木聚糖酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化木聚糖水解生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。 实验试剂 榉木木聚糖（sigma），木聚糖酶（苏柯汉），木糖 50mmol NaAC-HAC、DNS试剂、50mmol柠檬酸-Na2HPO4、50mmol甘氨酸-NaOH DNS（1L）配置方法： 取3,5-二硝基水杨酸6.3g溶于500ml水中，45℃水浴溶解后，加2mol/L的NaOH 262ml，不停搅拌，然后加入185g酒石酸钾钠，溶解后加入5g结晶酚（或6.25ml 80%的苯酚），溶解后加入亚硫酸钠5g，搅拌至溶解后冷却定容至1L。4℃保存，7天后可用，若有絮状物请过滤后使用，有效期为6个月。 50mmol NaAC-HAC：称取3.402gNaAC·3H2O 溶于蒸馏水中，定容至500ml；用移液器移取1.428ml HAC溶于蒸馏水中，定容至500ml。两者按V（NaAC）：V（HAC）≈2:1 体积配比，用pH计调节到pH5.0。 50mmol柠檬酸-Na2HPO4：称取柠檬酸5.2535gNa2HPO4 4.477g，溶于蒸馏水中定容至250ml；称取柠檬酸5.2535g溶于蒸馏水中定容至500ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。 50mmol甘氨酸-NaOH：称取甘氨酸 0.3735g溶于蒸馏水中，定容100ml；称取NaOH 0.200g溶于蒸馏水中，定容100ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。 仪器 水浴锅、分光光度计、电热套、烧杯、具塞刻度试管、移液器、电子天平 标准曲线的绘制 木糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水木糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容转移到100ml容量瓶中，再定容至刻度，摇匀，浓度为1mg/ml。 按下表制木糖标准曲线 表1、木糖标准曲线 管号 0 1 2 3 4 5 6 木糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 加2mlDNS试剂，沸水浴5min，冷水冷却至室温定容至25ml，540nm测吸光度 OD540nm 以木糖mg数为横坐标，光吸收值OD540nm为纵坐标，绘制标准曲线。 酶活测定 样品制备 榉木木聚糖溶液：准确称取榉木木聚糖，精确到0.001g。50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液用配成1%的榉木木聚糖溶液（最好现用现配，聚糖在酸性条件下易分解）。 木聚糖酶：准确称取木聚糖酶，精确到0.001g。用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度，保证吸光度在0.2-0.6之间。 DNS法测酶活： 取0.9ml 1%的榉木木聚糖溶液于25ml 具塞刻度试管中，加入0.1ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，加1ml蒸馏水，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。混匀测OD540nm。 空白用灭活的酶作对照。 结果计算 木聚糖酶活力（U/g）=r×Df×1000/150.14/t 式中： r：通过OD540nm值从标准曲线上查得与标准木糖溶液相对应的浓度（μg/ml）； 150.14：木糖的相对分子量，g/mol； t：酶解反应时间，min； Df：稀释倍数： 酶活力的计算值要保留三位有效数字。 木聚糖酶的最适pH 设置pH梯度3-10，间隔一个单位，来选择木聚糖酶的最适pH，由于榉木木聚糖在柠檬酸-Na2HPO4的溶解度不好，所以按下列方式选择缓冲液： pH 3、7、8 用50mmol柠檬酸-Na2HPO4缓冲液； pH 4、5、6 用50mmol NaAC-HAC 缓冲液； pH 9、10 用50mmol甘氨酸-NaOH。 分别用不同pH值的缓冲液配置适量的1%的榉木木聚糖溶液和相应稀释倍数的木聚糖酶液，在最适温度下按酶活测定方法测定，选出最适pH。 木聚糖酶的pH稳定性 分别用不同pH梯度的缓冲液配置适当稀释浓度的酶液，在最适温度下保温2h，然后在最适温度下按木聚糖酶酶活测定方法测定，选出pH稳定区间。 最适温度 在最适pH 的条件下，选择一系列温度梯度，分别在30、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100℃下按酶活测定方法测定酶活，确定最适温度。 温度稳定性 在最适pH 条件下，将木聚糖酶溶液在一系列温度梯度中保温2h，然后测