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2003秋季高级生化技术教程 一、 细胞培养技术  （一）简介与回顾 一、 细胞培养技术  （二） 基本概念 一、 细胞培养技术  （二） 基本概念 一、 细胞培养技术  （二） 基本概念 无菌室 超净工作台恒温培养箱 离心机例置相差显微镜　　　 水浴箱、解剖剪 　　 镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯　　　　 培养瓶离心管　　　　　 吸管细胞记数板　　　　　 酒精灯 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤 一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤 2、动植物细胞的培养例一：例一 乳鼠肾细胞原代培养 准备工作 A． 培养用品消毒后，安放在超净工作台内， 紫外线消毒，做好洗手等准备工作. B． 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等 a 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死b 将小鼠进入盛有酒精的烧杯中数秒 c? 置超净工作台内 a 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔b 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱 a 取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中b 用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污. c 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，去净血液为 胰蛋白酶消化 将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。 加入5-8倍体积的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37℃水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。 当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态 加入1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中。 离心及计数  以800-1000转/分离心8-10分钟,超净工作台内开盖,取上清加入适量培养液,细胞计数后分装； 在细胞瓶(板)上标明细胞名称，代数，日期； 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37℃孵箱中培养 细胞观察 培养细胞每天观察，检查：A.污染与否? B.细胞生长状态 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染;如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，24h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成短梭状。 培养3-4天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界线清。 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。 甲醛固定法用于?细胞固定，适应于一般培养细胞的固定操作步骤：?1、用PSB洗  2、加固定液  3、处理5分钟  4、用PSB洗 伊红(结晶紫)染色用于普通细胞染色，操作步骤: ?1、用甲醛法固定细胞  2、配染色工作液  3、染5-10分钟  4、用脱色液脱洗5分钟  5、固定制片 一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤 例三 植物原生质体 的培养 一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤 一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤 一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤 通过动物细胞培养，生产具有重要医用价值的疫苗、单抗酶、生长因子等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。 众多研究焦中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品产率和质量。  问题 1 细胞培养中氨离子、乳酸、ＣＯ２的积累 ２细胞死亡与凋亡  ３培养基与细胞系  ４细胞大规模培养过程监控 二、 单克隆抗体制备技术  （七）单抗研究进展及其应用 提高单抗的特异性； 减少与正常细胞的交叉反应；