软骨源性形态发生蛋白 1 转基因细胞片初步探讨.pdfVIP

142 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, February 2014, Vol. 28, No.2 · · 软骨源性形态发生蛋白1 转基因细胞片的初步探讨 姚梅1 2 1 2 1 崔颖 王月田 张本 付文举 【摘  要】    目的  探讨软骨源性形态发生蛋白 1 （cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1 ）转基因细胞 片的构建及其活性鉴定。  方法  取 1 月龄新西兰白兔骨髓分离培养BMSCs ，取第3 ～6 代细胞进行实验。实验分为 3 组，A 组：腺病毒（adenovirus，Ad ）- 巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV ）- 人CDMP1 （human CDMP1 ，hCDMP1 ）- 内 部核糖体进入位点（internal ribosome entry site ，IRES ）- 增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP ） 转染BMSCs ，B 组：Ad-CMV-EGFP （空载体腺病毒）转染BMSCs ，C 组：未转染的BMSCs 。倒置荧光显微镜观察3 组细 胞荧光表达情况，MTT 法检测3 组细胞增殖活力。将3 组处于对数生长期的细胞接种于温度敏感性6 孔板获得细胞片， 行形态学及HE 染色观察，RT-PCR 及Western blot 检测3 组细胞片hCDMP1 和Ⅱ型胶原mRNA 及蛋白表达，阿利新蓝染 色检测糖胺聚糖（glycosaminoglycans ，GAG ）表达。  结果  倒置荧光显微镜下观察示转染细胞在72 h 表达明亮荧光， 转染效率达90%；MTT 法检测示，3 组细胞生长曲线基本呈S 形，培养1 ～9 d 吸光度（A ）值比较差异均无统计学意义 （P 0.05 ）。通过温度敏感性6 孔板体外可成功收获完整的三维立体细胞片结构，RT-PCR 及Western blot 检测示，A 组细 胞片中hCDMP1 和Ⅱ型胶原mRNA 及蛋白均呈阳性表达，B 、C 组均为阴性。HE 染色和阿利新蓝染色示，A 组纤维组织 丰富，细胞外基质较多，蓝色异染颗粒多；B 、C 组细胞外基质相对较少，无明显特异性蓝染颗粒；A 组GAG 阳性染色面 积明显低于B 、C 组，灰度值明显高于B 、C 组（P 0.05 ）。 结论  hCDMP1 基因转染的BMSCs 细胞片能表达Ⅱ型胶原 和GAG，具有成软骨活性，其克服了传统组织工程中细胞利用率低、支架异质性等缺点，有望构建出致密的组织工程软骨， 为软骨组织工程进一步发展提供了新思路。 【关键词】    软骨组织工程    细胞片    软骨源性形态发生蛋白 1 BMSCs    腺病毒基因转染 PRELIMINARY STUDY ON TRANSGENIC CELL SHEET WITH CARTILAGE-DERIVED MORPHOGENETIC /YAO Mei1 2 1 2 1 1 PROTEIN 1 , CUI Ying , WANG Yuetian , ZHANG Ben , FU Wenju . Graduate School of Liaoning Medical College, Jinzhou Liaoning, 121000, P.R.China 2Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College. ； Corresponding author: