棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒p40、chi基因克隆及chi基因在大肠杆菌和昆虫的细胞中的表达.pdf

摘 要 本文通过建立了棉铃虫(Ilelicovorpa 一’_。-—-—————·—一 一步分析了p40基因序列和几丁质酶基因序列，并在大肠杆菌和昆虫细胞中表达了几丁质 酶基因。 ／在棉铃虫虫体内增殖了ttaSNPVCl株，从提纯多角体中提取基因组DNA。应用Ba廊tI、 肪0RI、EcoRV、肼ndlII、PstI、XbM和XhoI7种限制性内切酶分别将基因组DNA完全酶 切，条带数分别为l 准，求得各片段的长度， HaSNPV基因组文库。 1 端测序得到ItaSNPVp40基因全序列，HindI p40基因有98％的相同性，其翻译起始位点上游都 V40基因编码区全长966bp，与HzSNPV 有一个保守的晚期转录起始位点ATAAG。从HaSNPVp40基因核苷酸序列推测其编码蛋白分 子量为36．58kD，其氨基酸序列与BmNPV 左右，但HasNPV 的同源基因相对应区域比较，相似性在60％以上，并且七种基因中存在3个保守的半胱氨酸。 对以上七种同源基因编码的氨基酸序列分析，结果表叫P40蛋白溶解性都低于30％。进…步 绘出了七种杆状病毒P40蛋白进化树。 克隆，测定了E片段全序列。该片段含有完整的、以ATG为起始密码子、编码多肽不少于 50个氨基酸的ORF 质沙雷氏菌(Serratia marcescens 55％。HaSNPV几丁质酶对应于S 个疏水性氨基酸组成的假定信号肽序列， C端有一个假定的内质网保留信号序列HNEL。 根据HaNPV几丁质酶基因5 b k-：右的蛋fJ。 印迹检测，确定表达出分予量为60kD 将PCR扩增出的HaSNPV chis綦因构建到杆状病毒一昆虫表达系统的供体质粒 左右。沙7／ 本论文的创新点主要有： 精确物理图谱。 II 2．克隆了包含几丁质酶基因的HaSNPV基因组HindI E片段，测定了E片段全序列。 因。 4．在昆虫细胞中高效表达了HaSNPV缺失假定信号肽的儿丁质酶基因。 本文尤其较系统研究了ttaSNPV几丁质酶基因，为进一步的应用研究提供了基础。 前 言 杆状病毒是一种重要的微生物资源，其作为昆虫病原性天敌在生物防治中的应用， 特别是作为基因工程表达载体的应用已受到人们的高度重视和大力丌发。目前已丌发出 多种杆状病毒表达系统，并且已有不少表达成功的生物制品商品化。棉铃虫核型多角体 病毒属于杆状病毒科，单粒包埋型核型多角体病毒亚属，在国内70年代已用来防治棉铃 虫和菜青虫，现已有商品杀虫剂。天然棉铃虫核型多角体病毒在长期进化中，形成了多 种为其自身最大限度地占有生态位的机制，比如编码一种阻止昆虫蜕皮的基因，其毒力 基因在晚期表达等，这样不符合人类以其作为高效、快速的生物杀虫剂的要求。目前在 分子水平上已有报道将其推迟寄主蜕皮、加大昆虫取食量的早期表达基因蜕皮甾体尿苷 P￡盆，，2000)。 二磷酸转移酶敲除，代之以Bt毒素基因(Chen 几丁质酶普遍存在于昆虫、植物、微生物和软体动物体内，其功能主要是参与植物 真菌有显著抗性。杆状病毒几丁质酶基因是晚期表达基因，在感染后期起降解昆虫表皮几 m日FCOSCODS et 丁质的作用，其基因结构类似于s chn(Hawtin 几丁质酶研究最详细，已对其进行了表达、缺失、酶活性位点鉴别和细胞内定位研究 et ot (Thomasa』，1998，2000：Hawtinal，1995，1997)。 白是包涵体病毒囊膜结构组份或